第一部分 色谱基础知识

1、色谱起源

2、色谱定义

色谱法：利用组分在两相间分配系数不同而进行分离的技术

流动相：携带样品流过整个系统的流体

固定相：静止不动的一相，色谱柱

3、色谱分类

1、高效液相色谱 High Performance Liquid Chromatography (HPLC)

2、气相色谱 Gas Chromatography (GC)

3、薄层色谱 Thin-Layer Chromatography (TLC)

4、毛细管电泳 Capillary Electrophoresis(CE)

4、色谱优点

1、同时分析

2、分离性能好

3、灵敏度高 (ppm-ppb)

4、进样量小 (1-100uL)

HPLC vs GC

液相色谱：以液体作为流动相的色谱分离方法

1、适用于高沸点、大分子、强极性和热稳定性差的化合物的分析

2、流动相具有运载样品分子和选择性分离的双重作用

气相色谱：以气体作为流动相的色谱分离方法

1、适用于沸点较低、热稳定性好的中小分子化合物的分析

2、流动相只起运载样品分子的能力

5、HPLC分类

1、正相模式 (NP-LC)

2、反相模式 (RP-LC)

3、反相离子对色谱 (IPC) 
4、离子交换色谱 (IEC)

5、尺寸排阻色谱 (GPC / GFC)

反相模式 (RP)

填料：C18 (ODS)、C8 (octyl)、C4 (butyl)、苯基、TMS和氰基

相互作用力：

反相模式下流动相的选择：

优化水相（缓冲液）和有机相的比例非常重要（甲醇，乙腈和 THF 是常用的有机溶剂）

在有缓冲液的情况下, 缓冲液的浓度和pH值非常重要

增加流动相极性：

固定相极性变化对分离的影响：

固定相极性变化对分离的影响：

离子对色谱

离子对试剂

•阴离子化合物：氢氧化四丁基铵、溴化四丁基铵

•阳离子化合物：丁烷基磺酸钠(C4)、戊烷基磺酸钠(C5)、己烷基磺酸钠(C6）、庚烷基磺酸钠(C7)、辛烷基磺酸钠(C8)、癸烷基磺酸钠(C10)、十二烷基磺酸钠(SDS)

离子对色谱影响因素

•离子对试剂的类型

•离子对试剂的浓度

•流动相的pH

正相色谱

色谱柱：

•硅胶柱:常用

•氰基柱: 常用

•氨基柱: 分析糖

•二醇基柱: 分析蛋白质

相互作用力

氢键力

•如果样品有

–-COOH: 羧基

–-NH2: 氨基

–-OH: 羟基

则氢键力强.

•如果样品没有任何官能团，象碳水化合物

•如果样品有大的基团, 由于空间障碍

则氢键力弱.

正相模式下流动相的选择：

•主要试剂：烷烃(戊烷, 己烷, 庚烷, 辛烷)、芳香烃(苯, 甲苯, 二甲苯)、二氯甲烷–氯仿、四氯化碳

•辅助试剂：甲基-t-丁基醚(MTBE)、乙醚、四氢呋喃(THF)、二氧杂环乙烷、嘧啶、乙酸乙酯、乙腈、丙酮、异丙醇、乙醇、甲醇

为了调整保留时间，可以选择主要试剂然后再加入辅助试剂。

增加流动相极性：

反相色谱与正相色谱的对比：

反相：保留时间重复性好、固定相耐用

正相：对立体异构体有很好的分离(Vitamin E等)、保留时间重复性稍差

离子交换色谱：

离子交换色谱应用：

生物领域(蛋白质, 农药, 氨基酸分析)

离子分析

阳离子交换剂：强阳离子交换剂(SCX)(R-SO3-)

弱阳离子交换剂(WCX) (R-COO-)

阴离子交换剂：强阴离子交换剂(SAX) (R4N+)

弱阴离子交换剂(WAX)(DEAE)

尺寸排阻色谱法（SEC）

第二部分 柱子基本性能参数

1、表征色谱柱的参数

硅胶纯度：填料硅胶的纯度与残留金属离子浓度。

色谱柱尺寸：填料床的长度和内径。

颗粒形状：球型或不规则型。

粒径：平均颗粒直径,通常3-10μm。

表面积：颗粒外表面和内部孔表面的总和,以m2/g表示。

孔径：颗粒的孔或腔的平均尺寸,范围80-300Å。

碳百分率：与基体物质相连的键合相的量。

封尾：用短链将裸露的硅羟基键合后封闭起来。

2、表征色谱柱性能的参数

（1）容量因子, k'

（2）理论塔板数, N

（3）分离度, Resolution

完全分离时的分离度