柱层析是世界各地实验室中最常用的纯化技术。如果做得好，它可以简单快速地从混合物中分离出所需的化合物。但是，与许多化学实践一样，快速有效地设置和运行色谱柱可能需要数年才能掌握。在这里，小编将提供了一些柱层析的小tips和技巧，对柱层析过程中常遇到的一些问题进行故障排除并给出替代方案。
1、装柱
装柱子（添硅胶）时，常用的有两种方法：即湿法装柱和干法装柱，二者各有优劣。不论干法还是湿法，硅胶（称为固定相更为广义）的上表面一定要平整，并且硅胶（固定相）的高度一般为15cm左右（长度没有绝对之说，根据自身情况而定，制备的大柱可以长达一米），太短了可能分离效果不好，太长了也会由于扩散或拖尾导致分离效果不好。
湿法装柱是先把硅胶用适当的溶剂拌匀后，再填入柱子中，然后再加压（土方法可以用养鱼的氧气泵加压或是用氮气，当然不加压也可以）用淋洗剂"走柱子"，本法最大的优点是一般柱子装的比较结实，没有气泡。（我一般都用湿法装柱）
干法装柱则是直接往柱子里填入硅胶，然后再轻轻敲打柱子两侧（湿法也要敲的，效果好点），至硅胶界面不再下降为止，然后再填入硅胶至合适高度，最后再用油泵直接抽，这样就会使得柱子装的很结实（一般柱子不敢用油泵抽，怕把柱子抽裂了）。接着是用淋洗剂"走柱子"，一般淋洗剂是采用TLC分析得到的展开剂的比例再稀释一倍后的溶剂。通常上面加压，下面再用油泵抽，这样可以加快速度。干法装柱较方便，但最大的缺陷在于"走柱子"时，由于溶剂和硅胶之间的吸附放热（可以用手摸柱子明显感觉到）（梯度洗脱时，湿法装柱也会出现该情况，比较不好处理，可以缓慢改变溶剂，且置于通风处），容易产生气泡，这一点在使用低沸点的淋洗剂时如乙醚（用乙醚最最明显），二氯甲烷更为明显。虽然产生的气泡在加压的情况下不易察觉，但是，一旦撤去压力，如在上样、加溶剂等操作的时候，气泡就会释放出来，严重时，整个柱子变花，样品不可能平整地通过，当然也就谈不上分离了。解决的办法是：
第一、硅胶一定要压结实；
第二、 一定要用较多的溶剂"走柱子"，一定要到柱子的下端不再发烫，恢复到室温后再撤去压力。
也有介绍在硅胶的最上层填上一小层石英砂(我一般垫张滤纸，撒上石英砂，再放些棉花)，防止添加溶剂的时候，使得样品层不再整齐。但我的感觉是如果小心上样，添加溶剂，则没有这个必要。
湿法上样
1. 将样品溶解在最少量的溶剂中（5-10滴）。此处允许使用比洗脱溶剂稍微更极性的溶剂。如果您需要使用二氯甲烷或更强的溶剂，可能优选下述干法上样方法。
2. 使用注射器或吸管将样品直接滴到硅胶的顶部。尽量不要扰动硅胶表面，理想情况下，样品应在表面上均匀分布，以便形成薄的水平带。
3. 添加完整个样品后，让色谱柱排出，使溶剂水平接触二氧化硅顶部。
4. 小心地添加一层沙子（约2-5毫米）。这将有助于防止二氧化硅表面因添加更多溶剂而受到干扰。
5. 使用移液器小心添加更多溶剂，使溶剂水平高于沙子顶部约10 mm。
6. 让这种溶剂排出，直至溶剂水平高于砂子顶部约1-2毫米。
7. 重复步骤5和6一次或两次。这将确保您的样品被吸收到二氧化硅上。
8. 最后，根据需要添加尽可能多的溶剂，然后就可以开始运行列了。
如果您的化合物在溶剂系统中溶解度较差可以将样品干燥加载到色谱柱上。
干法上样
1. 将样品溶解在适当的溶剂中，并将其转移到圆底烧瓶中。
2. 向溶解的样品中加入干硅胶（约为样品质量的10-20倍）。
3. 轻轻搅拌混匀，使用旋转蒸发仪蒸发溶剂，直至二氧化硅干燥且能够自由流动。如果它仍然是油，则需要添加更多的硅胶并重复该过程。
4. 小心地将溶剂添加到色谱柱中，使溶剂水平高于硅胶顶部2-3厘米。使用移液器确保二氧化硅表面不受干扰。
5. 将干燥后的样品硅胶倒入色谱柱中，使其沉降。确保溶剂水平始终保持在二氧化硅顶部之上且不存在气泡。最好的方法是慢慢加入。
6. 按照上述湿法上样的步骤4-8，将样品完全吸收到色谱柱上。
收集馏分
在组分流出之前存在一定的死体积，死体积的大小取决于柱子的大小和分离的化合物，可在色谱柱上标记起始溶剂水平和下方对应二氧化硅长度的标记（图2）。一旦溶剂水平降至第二个标记以下，就可以开始收集馏分。
图2.死体积估计
接液体积
表1. 推荐参数
故障排除
表2.柱层析过程中遇到的常见问题及其解决方案。
最后，送大家一条建议：在没有拿到你想要的东西之前，不要扔掉任何你认为是杂质的东西，不然，你最后扔的极有可能是你的最终产物，到时候哭都来不及。
