Paraherquamide天然产物家族包含多种从青霉菌属中分离的代谢产物，有潜在的抗寄生虫活性，多种paraherquamide的类似物被合成，用于提高其药效。其生物合成路径包含分子内DA反应、不常见的氧化取代和螺环氧化吲哚(spiro-oxindole)的形成，赋予该物质生物活性。

Paraherquamide属于真菌吲哚生物碱家族，包含双环[2.2.2]二杂辛烷(bicyclo[2.2.2]diazaoctane)环系，通过分子内DA反应合成。螺环是众多天然产物的功能基团，合成螺环的酶被认为参与到吲哚C2=C3的环氧化中，具有面选择性，可以控制环氧化物的开环。图1中NotB催化notoamide E的2,3-β面环氧化，生成非螺环产物；这条反应路径中，另一种黄素依赖单氧化酶(Flavin-dependent monooxygenase) NotI催化stephacidin A的2,3-α面环氧化生成notoamide B.黄素依赖单氧化酶可以在分子内DA反应前后进行环氧化，导致notoamide合成中的多变性。

图1 螺环氧化吲哚的生成及面选择性模型

随着对映选择性环氧化和螺环化合成方法的快速增长，生物催化在此类合成问题中的角色也正在被认识。酶的内禀选择性在合成化学中无可匹敌，伴随每个酶促反应的发现，生物合成的工具箱变得更加充实。特别是一些氧化酶可用于生成全合成起始物的对映选择性纯品。因此探索酶促环氧化和螺环化反应中仅有的几个酶是非常重要的。

本文探究的黄素依赖单氧化酶PhqK在图2的代谢途径中负责氧化Paraherquamide K和L生成Paraherquamide M和N，其机理与之前假设相同，即吲哚的α-环氧化，环氧C3开环产生C2羟基碳正离子，最后prenyl基团从C2迁移到C3产生2-氧化吲哚。本文第一次提供了此类螺环黄素单氧化酶的结构数据，阐明了环氧化合物的生成和Pinacol重排中生物催化的控制方式。

图2 黄素依赖单氧化酶PhqK参与的吲哚生物碱生物paraherquamide合成路径

图3 PhqK催化非天然底物的反应

作者获取了单氧化酶PhqK的晶体结构以及Paraherquamide K，Paraherquamide L，非天然底物 monochlorinated malbrancheamide B和monobrominated malbrancheamide C与PhqK复合物的晶体结构(见图3反应)。观察晶体结构发现底物和辅酶FAD的结合口袋被一条长通道相连，如图4。

图4 不含底物的PhqK以及与Paraherquamide K (14)，Paraherquamide L (15)结合的PhqK的晶体结构，可见底物与FAD之间的通道

黄素依赖单氧化酶的辅酶通常是动态的，其构象取决于底物结合状态和FAD的氧化态。在结合底物和无底物的PhqK晶体中，黄素采取 out 构象；黄素的还原可以诱导出 in 构象。作者未得到还原态FAD与蛋白的晶体结构，但通过包含 in 构象的单氧化酶HpxO同源模建出了 in 构象PhqK的结构。out 构象PhqK和 in 构象可以较好重合，后者C4a-OOH-FAD与底物距离相对前者明显缩短至6.5埃，如图5。

图5 底物14和15与 in 构象FAD(薰衣草色)和 out 构象FAD(橘色)的相对位置

观察发现底物Paraherquamide L在PhqK中采取α-氧化的取向，与另一底物的结合方式不同，如图6。1500 ns分子模拟发现Paraherquamide L在催化口袋中更加刚性，而Paraherquamide K相对柔性，利于环氧化的构象(productive conformation)少，这与观察到Paraherquamide L的反应活性更高相吻合。定点突变实验发现Gln232，Arg192和Asp47是关键残基，均与底物吲哚N-H接触。Arg192与 in 构象的黄素冲突，说明Arg192会伴随着FAD的摆动而一同运动。作者认为Arg192可以接近环氧化后的底物并传递质子实现开环，虽然Arg192距吲哚C2为7埃，但其侧链完全舒展时可以充分接近底物。PROPKA分析Arg192发现在底物和蛋白运动到催化构象时(Arg192接近底物) 其侧链pKa减小。作者认为蛋白质背景可以降低Arg192侧链质子酸性实现环氧化合物的质子化开环。

图6 左：两种底物的重叠比较；中：Paraherquamide L的刚性构象与 in 构象的FAD；右：Arg192和FAD间的冲突

分子模拟完成后，作者进行了DFT计算研究。如图7，选取包含多种取代基的吲哚片段和胍基代替Arg192，作者研究了C2羟基迁移的Route1和C3迁移的Route2。C6有供电子的OMe取代时能稳定C2-羟基碳正离子，而C3-羟基碳正离子不被稳定，因此Route1比Route2有利。

图7 简单模型下环氧化合物开环的两种反应路径

如图8，碳键的迁移是模型反应的决速步，在酸的存在下，可以显著降低Route1的能垒6.5 kcal/mol, 降低Route2的能垒3.9 kcal/mol。虽然两条路径能垒均有下降，但Route1仍是优势路径。上述结果说明实验观察到的螺环氧化吲哚产物是分子自身的重排倾向，酶PhqK的作用是通过酸性残基催化降低1,2-迁移的能垒。

图8 酸对环氧开环重排的决速步能垒影响