众所周知，羰基通常不存在于蛋白质中的，但当在蛋白质中引入该基团时，可以让蛋白质获得额外的反应性，这在化学生物学中已被证明是广泛有用的。然而在蛋白质中产生羰基的方法依赖于带有羰基的非天然氨基酸的共转化掺入或现有天然氨基酸的氧化转化(化学或酶促)。但是利用蛋白质中碳碳键直接获得羰基的方法却少有报道，如果可行的话，通过c-c键形成羰基化直接添加C=O基团的替代策略，将为增加有价值的反应性和扩展蛋白质中可能的功能提供强有力的方法。基于此，今日分享来自大不列颠及北爱尔兰联合王国牛津大学化学系Benjamin G. Davis等研究人员的成果Residue-Selective Protein C-Formylation viaSequential Difluoroalkylation-Hydrolysis，该论文发表在ACS Cent. Sci.上。

首先作者对最近提出的利用自由基来克服水中碳正离子或碳当量不适当的问题来合成碳碳的方法进行剖析，设想一种可以直接将蛋白质中碳氧键演变成羰基的方法。但是，经分析发现，该策略过于复杂，结合之前工作的发现，一些天然蛋白残基会与CF3•自由基发生反应，而CF3•自由基似乎位于适合某些芳香族蛋白残基（主要是Trp）的反应尖端。但由于天然残基常是惰性的，对其他碳自由基而言要求蛋白质中存在更多活性(非天然)自由基受体残基以形成碳碳键。但是作者未能直接合成有效的RC（O）•自由基，用于蛋白质的直接反应（图2b）。随后，作者根据研究其他含蛋白质的二氟烷基自由基的过程中发现可以在温和的条件下产生HCF2•且其对天然残基具有充分的反应性，同时还发现通过其固有的化学选择性与杂芳族残基(X = Trp > His，图2c)加合物中的Reimer-Tiemann水解偶联的反应性。

所以作者考虑了一种间接的方法，即有效地利用二氟甲基自由基作为掩盖的“ HC（O）•等效物”，用于蛋白质C-甲酰化（图2c）。所得的非蛋白残基C-甲酰基-Trp（Cfw）因此在C2处具有最小尺寸的反应基团。随后，作者证明了该基团可用于蛋白质中的选择性亲电子羰基介导的修饰以及用作增强的荧光团。

图2 蛋白质C-羰基化的潜在化学策略分析

接着就是，作者提出一种反向过程(从“CF2”: RCF2→RC(O)或HCF2→HC(O))来获得RC（O）•或HC（O）•等效物。方法是在水性条件下和有利于水解的电子环境(例如苄基)中适当定位二氟亚甲基前体。虽然CF2部分在饱和位置通常是稳定的，但是在(杂)芳烃中苄基或等效位置发现的卤代烷基部分可能更容易通过Reimer-Tiemann水解。

作者从测试合适的二氟烷基RCF2·自由基开始，经过系统性的探索测试，发现2-吡啶基砜支架（RCF2SO2py1，图3a）在通常用于蛋白质操作和反应的水性反应缓冲液中显示出有用的溶解性和良好的稳定性。以Ru(bpy)32+为光催化剂，通过光催化还原砜来引发自由基，对一系列可能的电子供体中的测试中发现，含水缓冲液中的抗坏血酸钠被证明对这些反应最有效。然而，在细胞应用中，发现使用非抗坏血酸条件确实取得了部分成功，这表明某些细胞存在的内源性生物反应物也可能代替抗坏血酸发挥作用。后在模拟典型蛋白质修饰方案的条件下（低标度/浓度，氨基酸残基作为限制性底物与过量的其他反应物），通过使用15N标记标准物的定量LC-MS监测显示Trp底物具有更高的反应活性，并在随后实验中证实，HCF2自由基对Trp底物具有残基选择性的二氟甲基化，产生的C-2-二氟甲基化Trp残基经历Reimer-Tiemann型脱卤作用，使蛋白质水解折叠成2-甲酰基Trp (Cfw)。

图3 还原引发的二氟甲基化作用范围

然后，作者在确定了模型残基中由Trp产生Cfw的潜在生产性和选择性流形之后，我们在肽类环境中测试这种潜在的反应性，即在多肽中进行了HC(O)•当量的测试。作者构建了两种短模型多肽底物：一种底物包含代表性的潜在蛋白原性芳香和/或亲核残基，KFWAWH中假定的竞争性反应位点（Phe，His和Lys以及Trp）以及相应的无Trp （Trp→Met，Tyr）发现“突变体”KFMAYH具有反应比较所需的最相似溶解度。为了分析反应混合物，作者采用了LC-MS和LC-MS / MS监测，并辅以数据依赖采集，以确保通过不断发展的中间体和产物的片段化来进行无偏分析。随后验证了从Trp到Cfw的二氟烷基化/水解序列的实用性，开发了针对Cfw单残基设计的MS可检测化学衍生方法（见图4）。

图4 肽中从Trp到Cfw的二氟烷基化/水解序列的验证。产物的合成TIC-MS光谱对比分析

在肽系统中证明了所需的反应性、位点选择性和水解Reimer-Tiemann成功能够使Trp选择性转化为Cfw后，作者开始研究蛋白质底物（图5）。选择马心脏肌红蛋白，在11个His、7个Phe和2个Tyr残基中含有两个Trp残基（Trp7和Trp14），因此可作为评估C-甲酰化序列化学选择性的良好试验（二氟甲基化水解，图5a，左中）。完整的蛋白质LC-MS验证产物的成功形成，其质量与二氟甲基化相对应，部分是表面水解的物种（图5a，左图）。作者利用胰蛋白酶消化评估反应的选择性，并通过LC-MS/MS分析所得肽。接下来作者测试了蛋白质底物范围。得到的标准条件可普遍适用于其他具有不同Trp含量（1-6个残基）和折叠状态（主要是α结构蛋白肌红蛋白；两种混合的α/β结构域蛋白溶菌酶和乳清蛋白以及主要的β结构蛋白胰蛋白酶）导致基本相似的良好二氟甲基化水平（全部转化率>60%，图5b）。最后，对于肽，在没有光催化剂或光的情况下，二氟甲基化不进行。

图5 连续的二氟烷基化水解可以获得蛋白质中的Cfw

随后，作者在蛋白质中对其化学选择性和荧光光谱进行了探究。将Cfw作为一种新的残基安装到潜在的反应位点中，增加了通过醛化甲酰基实现多种亲电“捕获”模式的可能性，这种模式可以补充和扩展其他反应模式。通过氘化物添加（使用NaBD4），Cfw在蛋白质中的明显和清晰的反应性已经得到证实，其效率大于90%。并对广泛有效使用的α-亲核试剂进行了测试，发现Cfw显示出明显的强固有反应性，并且只有在少数情况下需要连接催化剂。以这种方式，携带Cfw的蛋白质可以容易地用适合于19F NMR的19F标记物（图5c）进行标记。同时，还测试了Cfw中醛反应的第三种模式。含eqMyo的Cfw与一系列苯胺和烷基胺进行了现成的还原胺化反应，使用NaBH3CN作为二氟甲基化水解标记序列的一部分，使Cfw的转化率达到未优化的85%。

为了直接在含Cfw的蛋白质中检测这种红移的自体荧光，作者使用宽范围的紫外光透照（λmax=302nm），在高于天然Trp荧光发射波长（>480nm）的波长处进行检测。只有含有Cfw的样品显示出光发射（图5d）。

最后，作者测试了在细胞环境中的应用（图6）。采用荧光相关细胞分选（FACS）分析来鉴定那些在Cfw形成的发射频率下具有增强荧光的细胞（∼450 nm）。应用于人类T淋巴细胞（Jurkat）细胞的二氟甲基化/水解反应允许在二氟甲基化反应时间过程（<90 s）下鉴定条件，该时间过程允许在随后的水解处理后在活细胞中显著诱导荧光（见图6a）。虽然延长二氟甲基化反应时间导致细胞相关荧光增加，但也导致细胞活力降低。此外，与Cfw形成一致，在更高温度下对反应的“甲酰化”细胞进行水解处理后，观察到相关的荧光水平增加（见图6b），类似于在体外对蛋白质进行的观察。

图6 白血病人T淋巴细胞（Jurkat）细胞的二氟甲基化/水解和荧光活化分选

所以，作者通过开发在抗坏血酸盐存在下的还原性光催化蛋白质修饰可以有效地产生HCF2自由基，从而产生对Trp具有残基选择性的二氟甲基化；产生的C-2-二氟甲基化Trp残基经历Reimer-Tiemann型脱卤作用，使蛋白质水解折叠成2-甲酰基Trp (Cfw)。这种自由基加成-水解方案现在允许对蛋白质中的醛进行直接规模化的化学处理，允许其在已建立的醛标记和连接化学(腙连接、肟连接、还原性胺化、还原性氘化)中快速开发，同时具有新的位点(Trp)选择性。

【文章链接】https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acscentsci.0c01193

【D O  I】https://dx.doi.org/10.1021/acscentsci.0c01193