今天为大家分享一篇发表在JACS上的“ Reprogramming of Protein-Targeted Small-Molecule Medicines to RNA by Ribonuclease Recruitment”文章，本文的通讯作者是来自美国加利福尼亚州化学斯克里普斯研究所的Matthew D. Disney教授。

对已知药物进行重新编程，使其具有比传统靶点更强的活性和选择性的新靶点是具有挑战性的。通过研究RNA褶皱与已知小分子药物之间的结合作用，并挖掘人类RNA数据集，作者确定Dovitinib，一种受体酪氨酸激酶(RTK)抑制剂，结合前体到microRNA-21 (pre-miR-21)。Dovitinib被合理地重新编程为pre-miR-21，利用它作为RNA识别元件，在一个嵌合化合物中，也招募RNase L诱导RNA的催化降解。通过增强固有的RNA靶向活性和降低对细胞中典型RTK蛋白靶点的作用，嵌合体将pre-miR-21的选择性改变了2500倍，缓解了由miR-21过表达引起的三阴性乳腺癌和Alport综合征小鼠模型的疾病进展。因此，靶向降解可以显著提高选择性，甚至跨越不同的生物分子，例如，蛋白质与RNA。

图1： 通过识别RNA结合物对ReFRAME小分子库进行基于信息的重编程。（A）左：1024个成员的3*2 RNA内部循环库(3*2 ILL)的二级结构并汇总了9300个成员的ReFRAME库；右：文库和文库对比扫描探测了超过950万个RNA基序小分子相互作用的组合，以识别具有高亲和力的小分子药物结合的特殊RNA结构。（B）Dovitinib，一种临床使用的受体酪氨酸激酶(RTK)抑制剂，可能会对miR-21的前体(pre-miR-21)进行重编程。miR-21与许多疾病相关。miRNA通过与信使RNA（mRNA）的3’UTR序列互补和空间阻断核糖体组装或者通过RNA诱导沉默复核问题（RISC）诱导剪切来抑制mRNA的翻译。转录后，初始miRNAs（pri-miRNAs）通过核糖核酸酶Drosha处理为pre-miRNAS，运输至细胞质后，通过核酶Dicer进一步加工为成熟的miRNAs。Dovitinib能够特异性结合至Dicer处理的pre-miR-21位点。

图 2： （A）组分1,4和5的结构。作者寻求一种策略来引导组分1活性和对pre-miR-21的选择性，其中一种方法是靶向RNA降解。因此作者将组分1转化为RNA降解物或靶向嵌合体的核糖核酸酶（4，RIBOTAC）或靶向嵌合体的蛋白水解酶（5，PROTAC）。（B）作者探究组分1是否抑制了RNA的生物发生及其下游的生物学功能。事实上，组分1抑制了TNBC细胞中pre-miR-21加工，与推测的作用模式一致，抑制Dicer加工，增加了pre-miR-21水平，但保持pri-miR-21水平不变。在MDA-MB-231细胞中，与1相比，4显著增强了对pre-miR-21的选择性和效力。特别是在5μM剂量下，1使成熟miR-21水平降低了30%，而4在0.2 μM剂量下观察到类似的降低，效力增加了25倍。作者通过耦合泛素连接酶的招募体将1转化为PROTAC 5，其能降低FLT3水平，增加pre-miR-21水平，其程度与1相似。（C）设计的RIBOTAC 4与pre-miR-21结合，招募并局部激活核糖核酸酶L (RNase L)来切割靶标。（D）接下来作者进行了一系列的实验来研究1，RIBOTAC 4和PROTAC 5是否在功能上抑制MDA-MB-231细胞中细胞外信号调节激酶和miR-21调节蛋白RTK和下游磷酸化。与1相比，PROTAC 5的RTK抑制增加了5倍，而RIBOTAC 4的RTK抑制减少了100倍。总之， 4对miR-21的抑制作用比1强25倍，对RTKs的功能抑制作用比1弱100倍

图3：RIBOTAC 4选择性抑制miR-21的原理。上图为评估RIBOTAC 4如何选择性抑制miR-21的实验流程图。

图4：接下来作者做一个整体性研究。1（1 μM,成熟miR-21水平不降低），4(1 μM,成熟miR-21水平降低45%),和一个靶向miR-21的寡核苷酸 (LNA-21 0.1 μM,成熟miR-21水平降低97%)。在MDA-MB-231细胞中，对所有三种化合物的蛋白质组均观察到适中的影响(检测到2965种蛋白质，受影响的比例小于或等于1.5%)，表明了选择性。（D-F）通过量化分析这三种化合物对由miR-21调控的mRNA编码的蛋白水平的影响，在4和LNA-21处理下，这些蛋白有显著变化。然而1 μM的1处理对miR-21调控蛋白无影响，可能是影响RTK相关通路。

图5：（A-C）作者进一步研究了1 (1 μM)、4 (1 μM)和LNA-21 (0.1 μM)在MDA-MB-231细胞中的转录组效应。在所有3个处理中普遍检测到的3567个基因中，28%(1070/3567)受显著影响，而4和LNA-21分别影响10.8%(387/3567)和11.8%(422/3567)。（D-F）类似地，比较每个可检测到的转录本的折叠变化，发现用RIBOTAC 4和LNA-21处理的转录组范围几乎相同，这与1不同(图5D F)。这些研究表明，在蛋白质组和转录组范围内，4和LNA-21对pre-miR-21的选择性比1更强，进一步支持了RIBOTAC将选择性转移到RNA上。

图6： 基于以上结果，作者研究了4s在异种移植小鼠模型（MDA-MB-231-Luc细胞）中抑制miR-21介导乳腺癌向肺转移的能力。（A）通过药物代谢和药代动力学(DMPK)分析，作者将RIBOTAC 4以一定剂量腹腔注射，达到肺内1 μM的药物暴露，这也表明该化合物在体内是稳定的。事实上，4治疗抑制了乳腺癌的转移停滞，这可以从与给药小鼠相比肺结节数量的减少得到证明。（B）肺组织学研究表明，治疗也可减少苏木精和伊红染色。荧光原位杂交(FISH)显示，4显著降低了miR-21和pre-miR-21的表达，而免疫组化(IHC)显示4抑制PDCD4的表达，而对ERK或pERK的水平没有影响。从而证明了重编程Dovitinib-based RIBOTAC在体内选择性调节miR-21水平的能力。值得注意的是，我们也用1治疗小鼠，研究其抑制转移的作用。由于1 s毒性，给药仅维持12天，此时小鼠肺结节尚未形成。

图7：（A）通过监测尿白蛋白归一化至尿肌酐水平来测量其对肾功能的影响。治疗1周后，白蛋白水平稳定，表明肾功能改善。（B）收集4处理和对照处理AS小鼠的肾脏并进行分析，发现通过RT-qPCR检测，成熟和pre-miR-21水平降低，过氧化物酶体增殖物激活受体α (PPARα)蛋白水平升高，这是miR-21抑制的一个靶点。（C）RIBOTAC 4降低Alport和WT小鼠肾脏中pre-miR-21水平。（D）相比之下，未观察到pERK水平的影响。组织学研究表明，疾病相关表型改善，肾小管间质病变和肾小球硬化明显减少。

研究方向：

迪士尼课题组专注于开发理性和可预测的方法，仅从基因组序列设计高度选择性的治疗方法。基因组测序工作的主要用途之一是推进患者特异性治疗，但此类进展只有很少的报道。迪士尼课题组利用从序列中注释RNA结构的进展和实验室最近开发的一些新技术来实现这个崇高的目标。迪士尼课题组目前的重点是利用这些技术进步，以确定针对孤儿病或预后不良的更常见疾病(如耐药癌症)的患者特异性治疗。

文献链接

https://pubs.acs.org/10.1021/jacs.1c02248

编辑：唐瑞

审核：路栩

推送：章振华