硫肽抗生素中咪唑哌啶杂环形成的酶学过程解析-上海纳孚生物科技有限公司

硫肽抗生素是一类富含硫、高度修饰的肽类天然产物，具有强大的抗感染活性。根据氧化态和中心六元杂环的不同，硫肽类抗生素分为5个亚族，即a型的哌啶(硫肽素A)、b型的脱氢哌啶(硫链丝菌肽)、c型的咪唑哌啶(Sch40832)、d型的吡啶(硫西林I)和e型的羟基吡啶(那西肽)(Figure 1A)。目前，对a、b、d和e四种类型的硫肽的生物合成途径研究较多，在形成机制上，其核心氮杂六元环均起始于[4+2]环加成反应，后通过脱水和加氢形成b型脱氢哌啶环，若继续加氢则形成a型饱和哌啶环；若环加成后发生脱水和脱除前导肽，则形成d型吡啶环，进一步羟化形成e型羟基吡啶环。但对于核心结构最为复杂的二氢咪唑并哌啶的c型硫肽，其酶促合成机理尚不明确。

近期，中国科学院上海有机化学研究所刘文研究员团队基于对Micromonospora carbonacea ATCC 39149相关基因的挖掘和表征，利用异源表达和体外生化实验，解析了c型硫肽类抗生素生物合成中二氢咪唑并哌啶形成的酶促过程：b型硫肽核心环首先被SchZ还原为a型硫肽核心环，紧接着在SchY催化下，哌啶与相邻噻唑发生氧化重排形成并环，生成c型硫肽中间产物。SchX和SchW则分别对并环上的巯基和醛基进行甲基化和还原，以形成稳定的成熟硫肽分子。

Figure 1. 硫肽抗生素分类和生物合成

(A) 硫肽类抗生素中心杂环的结构； (B) 与 Sch40832 相关的基因簇、生物合成途径和结构(蓝色代表咪唑哌啶形成，绿色代表糖基化)。

首先利用生物信息学分析从M. carbonacea ATCC 39149(即 CP058905)基因组序列中鉴定了一个基因簇(sch，Figure 1B)，推测其负责 Sch40832 的生物合成。与高度同源基因簇tsr(负责b型硫肽的合成)和 tpp(负责a和b型硫肽的合成)比对，定位了四个紧密聚集的基因schV(编码糖基转移酶)、schW(编码NADPH依赖的还原酶)、schX(编码甲基转移酶)和schY(编码P450酶)(Figure 1B)。由于M. carbonacea菌株无法进行基因操作，研究人员将基因schW、schX和schY以及它们的不同组合引入硫链丝菌素产生菌Streptomyces laurentii的突变体SL1051中(Figure 3B, 左)，遗憾的是，这些重组菌株均不能转化硫肽前体1(Figure 3A)，表明脱氢哌啶单元不是咪唑哌啶合成的直接前体。

Figure 2. 推测的酶促合成途径

随后，对基因簇sch进一步分析发现了一个远离基因schWXY(Figure 1B)的schZ基因，编码F₄₂₀依赖的氧化还原酶。为验证schZ的功能，将该基因引入SL1051，通过HPLC和HR-MS(Figure 3B, 右)检测产物的变化。结果显示，大部分前体1转化为+2 Da的产物2([M+H]⁺m/z: 1681.5162，C₇₃H₈₉N₁₈O₁₉S₅)。通过NMR进一步分析纯化的产物2(Figure 3A)，发现2和1在¹H和¹³C NMR中高度相似，差异在于核心中心环。根据HMBC 和 ¹H-¹H COSY相关，确定2为1的衍生物，含有饱和哌啶环(Figure 3A)。接着，在大肠杆菌中过表达SchZ并在体外测定其活性，结果如预期，在存在TppX5的情况下SchZ可以催化产物1到2的还原(Figure 2和4A)。基于此结果，研究人员又在该重组菌株中继续引入了schW、schX和/或schY，以探索是否可以发生进一步的转化(Figure 3B, 右)，发现除了1和2之外，只有共表达schWXYZ的重组菌株产生了少量的新产物(3，[M+H]⁺ m/z: 1713.5431，C₇₄H₉₃N₁₈O₂₀S₅)。核磁解析分析3中含有咪唑哌啶单元，为c型硫肽。因此，推测SL1051内中心杂环由SchWXY催化含哌啶的硫肽中间体2形成。

Figure 3. 菌株S. laurentii中产物及其衍生物检测

(A) 硫链丝菌肽及其衍生物 1、2和 3 的结构； (B) 通过 HPLC ( λ = 254 nm) 分析 S. laurentii菌株的产物 (左：i，野生型；ii; ΔtsrB 突变体；和iii、iv 和 v，分别表达 schY、schYX 和 schYXW 的ΔtsrB 突变体。右：i；ΔtsrB 突变体；和 ii、iii、iv 和v，ΔtsrB 突变体，其中分别表达了 schZ、schYZ、schYXZ 和 schYXWZ)。

研究人员采用一锅法合成验证SchW、SchX和SchY是否能将2转化为3(Figure 4C)。除了纯化的SchW、SchX和SchY，反应混合物还包括SAM(作为甲基供体)、葡萄糖6-磷酸脱氢酶(G6PD)(通过原位转化葡萄糖6-磷酸(G6P)提供NADPH)以及铁氧化还原蛋白(Fdx)和铁氧化还原蛋白-NADP⁺还原酶(FdR)对(用于细胞色素P450 相关催化中的电子转移)。观察到化合物3的产生，表明SchWXY参与了从a型底物类似Sch40832的c型硫肽的合成。但与在schWXYZ共表达的SL1051重组菌株中的观察结果一致，该转化效率较低，推测可能归因于SchY活性较差。于是挖掘了与SchY高度同源的AchY，编码该蛋白的基因位于Actinoalloteichus hoggarensis DSM 45943中类似于sch基因簇(即ach)。以AchY替代SchY，在30°C下孵育6小时后，化合物2以时间依赖性转化(Figure 4C)，且3的产量高于使用SchY时的产量，表明AchY在转化2方面上比SchY更有效。

Figure 4. 通过 HPLC (λ = 254 nm) 检测咪唑哌啶的形成。

(A) SchZ 活性的体外测定。1在(i)灭活的 SchZ，(ii)SchZ中转化，(iii)标准品 1和 (iv) 2； (B) 相关硫肽中间体/衍生物的中心杂环的结构； (C) SchY、SchW 和 SchX 活性的体外测定。2在灭活的 AchY 和 SchXW (i)、SchYXW(ii)、AchY 和 SchXW (iii)、灭活的 AchY (iv)、AchY (v)、灭活的 AchY 和 SchX (vi)、AchY和 SchX (vii)，灭活的 AchY 和 SchW (viii)，以及AchY 和 SchW (ix)中转化, 标准品2(x)和3(xi)。

为揭示AchY功能及咪唑哌啶的形成机制。将AchY单独孵育后，发现约50%的产物2被消耗掉，但无明显可见的新产物生成(Figure 4C)。推测AchY可能作为单加氧酶启动咪唑哌啶的形成，通过选择性催化硫肽大环外哌啶相邻噻唑单元中的C4'-C5'环氧化(Figure 2)，接着哌啶的N1原子亲核进攻生成C-N键，随后C-S键裂解，得到带有醛基和硫醇基团的咪唑哌啶杂环，这两个基团都具有高反应性，可能会被反应混合物中的某些成分捕获，降低预测产物4(一种不稳定的c系列硫肽中间体)的可检测性(Figure 4B)，导致反应中的HPLC-HR-MS只能显示出痕量4([M+ H]⁺ m/z: 1697.5107，C₇₃H₈₉N₁₈O₂₀S₅)(Figure 4B)。为证实该推测，在含有羟胺的混合物中进行AchY对2的催化转化。正如预期，形成了4的+15 Da衍生物5([M+H]⁺m/z: 1712.5221，C₇₃H₉₀N₁₉O₂₀S₅)(Figure 4B)。接着，在碘乙酰胺(IAA，一种硫醇衍生试剂)参与的反应混合物中产生了4的+72 Da衍生物6([M+ H]⁺m/z: 1769.5459，C₇₅H₉₃N₂₀O₂₁S₅)(Figure 4B)，验证了硫醇基团的存在。由此可见，AchY是一种咪唑哌啶合酶，通过氧化哌啶-噻唑单元介导结构重排从而形成c系列硫肽。

最后，硫醇S-甲基化的SchX活性和醛还原的SchW活性被分别证实。将SchW或SchX加入反应混合物，约50%的2被消耗(Figure 4C)。在SchX的催化下，中间体4被S-甲基化为甲基巯基中间体7([M+ H]⁺m/z: 1711.5287，C₇₄H₉₁N₁₈O₂₀S₅，Figure 4B)。在反应中加入羟胺得到衍生物8([M+H]⁺m/z: 1726.5388，C₇₄H₉₂N₁₉O₂₀S₅，Figure 4B)证实了醛基的存在。同样，在SchW的催化下，中间体4被还原为醇中间体9([M+H]⁺m/z: 1699.5278，C₇₃H₉₁N₁₈O₂₀S₅)。

综上所述，研究人员通过基因重组异源转化和广泛的体外生化实验解析了c型硫肽抗生素形成的酶促过程。该过程开始于一系列b型硫链丝菌肽前体，通过一个F₄₂₀依赖的哌啶合成酶催化脱氢哌啶还原得到a硫肽中间体。然后，细胞色素P450蛋白将邻近的外环噻唑单元氧化，并通过环氧化、C-N键和C-S键裂解进行结构重排与哌啶偶联。最后，通过NADPH依赖的还原酶进行进一步醛还原和SAM依赖的甲基转移酶参与的硫醇S-甲基化，形成c硫肽型咪唑哌啶杂环。本研究进一步加深了科研人员对硫肽抗生素生物合成的理解，例证了自然界如何从富含Cys和Ser/Thr的肽序列形成结构复杂和多样天然产物的过程，促进生物工程用于扩展分子多样性和用途。

本文通讯作者刘文研究员主要从事复杂天然产物的生物合成、以基因组扫描为手段新型天然产物的发现以及以产量提高和结构多样性为目的组合生物合成研究。

文章信息：Botao Cheng, Heng Guo, Haoyang Wang, Qunfei Zhao, and Wen Liu*. Dissection of the Enzymatic Process for Forming a Central Imidazopiperidine Heterocycle in the Biosynthesis of a Series c Thiopeptide Antibiotic. J. Am. Chem. Soc. 2021, 143, 13790−13797. https://doi.org/10.1021/jacs.1c05956