今天为大家分享一篇发表在Cell Chemical Biology上的文章，文章的题目是“Chemoproteomics profiling of surfactin-producing nonribosomal peptide synthetases in living bacterial cells”。其通讯作者是来自近畿大学药学院的Genzoh Tanabe教授和Fumihiro Ishikawa教授，他们的实验室主要研究药物化学。本文中，作者对非核糖体肽合成酶NRPS进行了研究。
非核糖体肽合成酶NRPS是一大类产生天然肽及其衍生物的酶，具有丰富的结构和功能。NRPS的广为人知的底物包括万古霉素、抗肿瘤药物博来霉素和免疫抑制剂环孢霉素等。经典的NRPS模块由3种酶组成：腺苷化（A）、巯基化（T）和缩合（C）domain，A domain首先催化氨基酸形成氨基-AMP中间体，T domain随后亲核进攻该中间体得到氨基-S-T中间体，并最终通过C domain催化两个氨基-S-T中间体形成肽键。当前，关于NRPS的研究往往局限于基于异源表达的体外研究策略。而对内源NRPS的研究才刚刚起步，以融合表达荧光蛋白标签和过表达体系+单克隆抗体等方法为主。这些方法不仅需要进行过表达实验，破坏了天然的生理条件，同时也无法直接检测内源NRPS的活性，因此开发一种直接、内源的NRPS研究方法非常关键。基于活性的蛋白质分析ABPP是一种非常适合在天然条件下研究内源蛋白的工具，通过使用基于活性的共价探针对目的蛋白进行标记即可开展一系列的下游研究。
作者首先进行了化学探针的设计工作。作者首先选择了枯草杆菌ATCC 21332进行分析，其合成表面活性素surfactin的过程是由3种NRPS酶复合物共同完成的。其中SrfAB-NRPS中的一个A domain对Asp具有高度保守的底物选择性。因此作者合成了L-Asp-AMS-BPyne探针对其这个Asp激活的结构域进行标记，同时作者在探针上组装了二苯甲酮和炔基用于光交联和后续富集等实验。接着作者在裂解物中进行了体外标记实验。他们直接将探针加入到细菌蛋白质组中，并使用UV处理、荧光标记，并平行地用不带光交联和炔基基团的Asp-AMS竞争。结果显示，该探针对SrfAB-NRPS具有非常高的选择性。随后作者直接在活细菌上进行探针的内源标记，结果显示，其能够穿透细胞，并以高选择性的方式标记SrfAB-NRPS，背景也控制的很好。在验证了探针的可行性后，作者接下来使用这一探针进行了活细胞内NRPS活性的研究。在测试了探针在活细胞内荧光成像的能力之后，他们将收集的菌体用PBS重悬，并加入探针进行为期1 h的标记。随后的活细胞水平的CuAAC反应结果显示，荧光信号扩散到整个细胞质。这与之前关于NRPS的亚细胞定位研究是符合的。最后，作者研究了SrfAB-NRPS在活细胞内的动态变化。在对不同时间点的菌体进行探针标记后，他们惊讶地发现，在SrfAB-NRPS下方出现了一个新的条带。他们猜测，这一条带可能对应的是SrfAB-NRPS的降解产物。为了验证这一猜想，作者合成了一系列氨基酸-AMS来进行竞争性ABPP实验，结果只有Asn和Asp产生了明显的竞争信号，且竞争模式与SrfAB-NRPS抑制，说明该截断体的确来自SrfAB-NRPS，且包含了具有Asp选择性的A domain。为了进一步确定该截断体，他们采用了切胶酶切策略。根据LC-MS/MS的序列覆盖度，他们证明这一截断体确实部分来自于SrfAB-NRPS C端的E和T domain，由此揭示了一种新的SrfAB-NRPS降解过程。
综上所述，在本文中作者开发了一种高选择性靶向非核糖体肽合成酶SrfAB-NRPS中Asp选择性结构域的化学探针，实现了在活细胞内对SrfAB-NRPS的荧光标记，并通过切胶质谱的方法揭示了一种新的SrfAB-NRPS降解过程。https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2451945621002592原文引用：DOI：10.1016/j.chembiol.2021.05.014
