今天分享的是本月JACS上ASAP的文章，作者是意大利比萨大学的Benedetta Mennucci教授。

DOI：10.1021/jacs.0c10461

本文图片(除图1)来自J. Am. Chem. Soc.

细菌是地球上可进行光合作用的最古老的生物类型，对细菌光合作用的研究可以帮助人们更好地理解光合作用的产生和演化。多数光合作用细菌是不产氧的，但蓝细菌(cyanobacteria)的光合作用使用水作为电子供体并释放氧气，与植物光合作用相似。蓝细菌进化出了一种光保护系统，在光线强度超过光合作用可接纳的强度时，能防止过量光线对组织的破坏。光保护与光捕获相互竞争：前者通过非光化学淬灭(nonphotochemical quenching, NPQ)使过量光能迅速消散为热能；后者在生物膜上引入其他蛋白，扩大有效受光面积，捕捉更多光子并传递给光合作用反应中心，从而提高光合作用效率，如图1。与植物和藻类不同，蓝细菌的光保护和光捕获是同一套系统完成的。这套系统中的水溶性蛋白“橙色类胡萝卜素蛋白”(Orange Carotenoid Protein, OCP)引导了能量消散过程，作者对这个关键蛋白做了分子动力学模拟。

图1 光合作用膜反应复合物示意图，LH1和LH2是光捕获蛋白1和2，灰绿色方片是细菌叶绿素。图片来自Carl Branden, John Tooze. Introduction to protein structure (1999, Garland Science)

OCP包含两个结构域，分别是N-端和C-端结构域，如图2，简记为NTD(黄色)和CTD(蓝色)。NTD和CTD的末端分别是NTE(洋红)和CTT(绿色)，两结构域由linker相连(银色)。除NTD和CTD之间的主接触面外，NTE和CTT也形成了次接触面。OCP有两种可转化的构象，橙色的OCP_O和红色的OCP_R。OCP_O中，类胡萝卜素分子结合在横跨NTD和CTD的口袋，通过两个氢键与CTD紧密相连。NPQ过程中，闭合的橙色OCP_O吸收强蓝光，转化为OCP_R并具备活性。同时，类胡萝卜素移位到NTD一侧，NTD与CTD解离，如图3。红色的OCP_R引发后续NPQ过程。

图2 OCP与类胡萝卜素复合物的晶体结构，W_288和Y_201与类胡萝卜素形成氢键。

图3 OCP_O经历类胡萝卜素移位和结构域解离转化为OCP_R。

作者用原子级分子模拟详细揭示了OCP异构过程。光激发过程需要量子力学的动力学描述，但当前的计算能力只能处理极短的过程。另外类胡萝卜素移位的时间尺度为纳秒至微秒级，两结构域解离为微秒级事件。为克服较大的时间尺度，作者使用伞取样(umbrella sampling, US)与REMD(replica exchange MD)相结合的增强采样方案。

作者定义类胡萝卜素和NTD的质心间距离为反应坐标(collective variable, CV)，US-REMD所得能量轮廓如图4。由于类胡萝卜素分子最终抵达NTD结构域，因此CV最大值处(右侧)是反应起点。通过分析RMSD，作者断定CV=11.5埃处全局最小点结构为OCP_O，如图5。由右向左，经历较小能垒抵达局域最小点T1，CV=7.5埃。T1中的类胡萝卜素稍稍离开结合口袋，两个氢键已经打断。除此之外，T1大体保持OCP_O的构象。T1向左翻越最高能垒后抵达T2，T2中的类胡萝卜素已经离开T1，如图5。

图4  沿反应坐标的自由能面(由右向左)。

图5 (上) CV=11.5埃处结构(蓝色)与OCP_O(橙色)重叠图像；(下) CV=2.5埃处结构(T2，蓝色)与相关蛋白RCP晶体结构的重叠图像， 说明类胡萝卜素在T2中的位置是合理的。

图6 (上) T1(蓝色)与OCP_O(橙色)的重叠图像；(下) T2(红色)与OCP_O(橙色)的重叠图像。

随后，作者分析了类胡萝卜素移位的驱动力，绘制类胡萝卜素与蛋白的作用能、与水的作用能和分子内能相对于反应坐标(由右向左)的图像，如图7。自移位伊始，类胡萝卜素与水的有利作用强有力地抵消了移位过程中与蛋白的排斥。此处，类胡萝卜素丢失了与CTD的两个氢键造成了与蛋白的排斥，如图6。溶剂水是稳定T1和T2的主角，虽然类胡萝卜素在OCP_O中与W_288和Y_201形成的氢键是溶剂不可及的，但随着体系向T1运动，类胡萝卜素的溶剂可及表面逐步扩大。另外前人假设，光激发后扭曲的类胡萝卜素分子像弹簧一样推动OCP_O向OCP_R转变，但类胡萝卜素分子的内能在OCP_O至T1区间(图7)是增长的，与前人猜想相左。

图7 沿反应坐标，类胡萝卜素与蛋白和水的作用能(上)及其能量分解(下)。 

接下来，相互作用力被分解为色散和静电贡献两部分，分别对应LJ(Lennard-Jones)势和静电势，如图7。与直觉相悖，OPC_O中类胡萝卜素与NTD结合力更强，类胡萝卜素开始移位并逃出CTD双氢键成键范围后，与CTD结合力持续减弱，与NTD结合力持续增强。进一步分解作用力到各个残基后，作者发现移位开始后，NTD的多个残基都增强了与类胡萝卜素的LJ作用。这说明移位过程似乎不是由某些特定残基驱动的，而是受整体结合面的影响，特别是围绕结合口袋的非极性或芳香性残基与类胡萝卜素的LJ作用持续增加。

受内能变化的启发，作者分析了类胡萝卜素分子末端环状取代基在分子移位时的构象变化。作者定义二面角β1和β2来表征构象(Mio看完全文没有确定到底是哪两个二面角，毕竟这不是Mio的本行啦)，绘制β1和β2关于反应坐标的势能面，如图8。由于作者采用的力场经历了DFT计算修正，所以能够在纳秒尺度上描述类胡萝卜素环状取代基的旋转。对于β1，这个二面角在T2前被锁定在s-trans构象；β2与β1类似，但T1中环状取代基已经运动到口袋外，自由度增大，所以能在两s-cis构象间转化。T2时，末端两环自由度显著增大，正如图9中环取代基的混乱构象。

图8 类胡萝卜素末端环状取代二面角β2和β1沿着反应坐标的变化。

图9 两个环状取代基构象的重叠图像。

完成类胡萝卜素分子构象分析后，作者转而探究NTD和CTD解离的问题。一般认为，结构域解离是OCP光活化过程中的最慢步骤，由于解离后两结构域自由度增加，被认为伴随着显著熵效应，能抵消结构域间接触面消失所损失的结合能。因此，作者使用了well-tempered metadynamics (wt-MetaD)来高效探索解离过程。wt-MetaD的反应坐标选定为结构域间特定接触图(contact map, CM, 如下式)的存在和消失，解离前CM=0，解离完成CM=1，计算时同时向回转半径Rg和CM加偏(bias)势。

为作对比，作者运行了从OCP_O和T2处结构出发的wt-MetaD，结果如图10。定性地看，从OCP_O出发的分子不解离，构象被束缚在最小点附近；T2出发的分子非常迅速地解离，先抵达接触面消失的过渡区域(CM=1)，再逐步增大回转半径抵达终点。作者认为OCP_O和T2处wt-MetaD的不同结果并不奇怪，OCP_O状态中类胡萝卜素与NTD和CTD的结合能大约都在40 kcal/mol，类胡萝卜素移位后，与CTD的结合能下降到10 kcal/mol，使NTD和CTD的解离变得容易。另外，热力学上讲，两结构域接触面消失的能量损失可被溶剂化能补偿。作者又补充了从不含类胡萝卜素的OCP_O出发的wt-MetaD，与T2一样，此时两结构域能够解离。以上结果说明类胡萝卜素对OCP_O闭合构象的稳定非常重要，光激发后改变的类胡萝卜素-蛋白间作用模式促使了结构域解离。

图10 OCP_O和T2出发的wt-MetaD得到的构象向CM和Rg投影后的分布。

作者还分析了NTD和CTD结构域的稳定性，RMSD图如图11。NTD和CTD的RMSD均小于2埃，说明这两个结构域在解离过程中相当稳定。但是，对于NTE和CTT，RMSD变化明显，重叠多帧NTE和CTT的构象发现，解离过程中二者的朝向不固定，表现出无序卷曲状，这说明二者形成的次接触面对稳定二者的构象非常关键。

图11 NTE, NTD, CTD和CTT的RMSD。

最后，作者发现解离过程中类胡萝卜素在NTD中位置几乎不变，保持T2的状态，说明类胡萝卜素移位发生在结构域解离之前。另外，linker部分形成了新的α螺旋(图12)，在模拟中相当稳定，说明即使是蛋白中的低保守区，也有潜在的生物功能。

图12 完全解离的OCP。

总结：

作者用全原子分子模拟研究了OCP光活化后的反应历程，发现：只有类胡萝卜素移位后两结构域才能解离，解离后蛋白的二三级结构几乎不变。沿着反应坐标先后出现的中间体T1和T2与光谱发现的中间相对应。OCP_O中类胡萝卜素锁定两结构域，使其相对稳定；光激发后，类胡萝卜素像”门栓“一样移位到NTD，打破两结构域间相互作用的平衡，使其解离。这一历程与前人提出的“弹簧”模型不同。