导语：自然进化产生了两种醛缩酶：I型醛缩酶和II型醛缩酶。其中，利用高度保守的ε-氨基，I型醛缩酶通过共价形成的席夫碱活化aldol donor，随后形成高度亲核的烯胺物种；相反地，在II型醛缩酶中，金属辅因子（通常是Zn2+）作为Lewis酸通过与羰基络合来活化aldol donor，促进去质子化作用和烯醇化合物的形成。I型醛缩酶可以催化不对称aldol反应，被广泛应用于手性β-羟基酮的合成。在aldol反应中，一般以烯醇化的醛或酮作为亲核给体（aldol donor），而酮作为亲电受体（aldol acceptor）（Appl. Microbiol. Biotechnol. 2006, 71, 253; Trends Biochem. Sci. 1992, 17, 110）
研究现状
尽管可以通过蛋白质工程或新蛋白的发现等克服某些限制，然而，到目前为止，I型醛缩酶DERA（2-deoxy-D-ribose-5-phosphatealdolase）在机制相关的碳化反应如Morita-Baylis-Hillman、Michael、Mannich、Knoevenagel和Henry-type反应中的应用仍未被发现。如Scheme 1a所示，野生型DERA醛缩酶可以催化乙醛和D-甘油醛-3-磷酸的aldol反应。尽管DERA可以接受一些小的醛、酮如丙醛、丙酮和氟丙酮作为aldol donors，但是该酶有限的亲核范围限制了其更广泛的应用。此外，DERA催化非磷酸化aldol acceptors的效率较低，在工业乙醛浓度下，该酶的失活进一步限制了它的应用。
本文进展
近日，Gerrit J. Poelarends课题组在《ACS catalysis》上发表题为“Unlocking Asymmetric Michael Additions in an Archetypical Class I Aldolaseby Directed Evolution”的论文，（ACS Catal. 2021, 11, 13236−13243）报道了来源于大肠杆菌的经典I型醛缩酶DERA经过重新设计可以有效催化硝基甲烷与α,β-不饱和醛的Michael加成反应，反应生成了各种具有药效团的手性合成子。
Scheme 1. 通过酶结合的烯胺或亚胺离子中间体进行的DERA催化的碳化反应。（a）DERA催化的乙醛和D-甘油醛-3-磷酸生成2-脱氧-D-核糖-5-磷酸的aldol反应，与酶结合的底物被活化成为亲核的烯胺中间体；（b）DERA催化的硝基甲烷2和α,β-不饱和醛1a−j生成γ-硝基醛3a−j的Michael加成反应，酶结合的底物作为亲电的亚胺离子中间体被活化。参与反应的nucleophilic donor底物用蓝色突出显示，而electrophilic acceptor底物用红色突出显示。
（来源：ACS Catal.）
DERA的定向进化
野生型DERA不能催化天然供体乙醛和非天然受体反式-硝基苯乙烯的Michael加成反应；但可以催化硝基甲烷2与肉桂醛1a的Michael加成反应（e.r. = 96:4，38%转化率）。经过11轮定向进化，重新设计的DERA酶（DERA-MA）的12个氨基酸残基被突变，与野生型相比，其催化活性提高了190倍。对非生物反应的高催化效率使DERA-MA成为具有生物催化潜力的一种“Michaelase”。野生型醛缩酶通过激活作为亲核试剂的酶结合底物（基于烯胺机制）发挥作用，而DERA-MA则通过激活作为亲电试剂的酶结合底物（基于亚胺机制）发挥作用。
图1 DERA的定向进化
（来源：ACS Catal.）
DERA-MA催化2和1a的Michael加成反应的效率比之前改造的互变异构酶4-OT突变体（ACS Catal. 2019, 9, 4369）高100倍。4-OT为对称的同型六聚体，任何点突变都反映在六个亚基上，这给其优化带来了明显的限制。DERA的TIM桶状折叠结构更容易被优化，使改造的DERA-MA成为一个高效的“Michaelase”。当DERA-MA 167位的赖氨酸被亮氨酸取代时，催化活性降低了150倍。实验表明在DERA-MA催化2和1a的Michael加成反应中，K167通过形成一个亚胺离子激活1a，随后亲核进攻2（在去质子化后）形成一个新的碳-碳键，即K167具有催化席夫碱形成的重要功能。
DERA-MA的结构
图2 DERA-MA的晶体结构和活性位点
（来源：ACS Catal.）
为了解释DERA的催化机制，作者解析了DERA 的X射线衍射结构。DERA-MA的整体结构与野生型DERA几乎相同，催化赖氨酸K167靠近保守的K201和D102，K201和D102在DERA的天然催化机制中起着关键作用。DERA-MA（粉色）中loop β1-α2和β7-α8相对于野生型DERA具有显著的构象差异（图2a）。β1-α2的构象变化最大，可能受到周围突变C47S、F52S和K172L（绿色）的影响。野生型DERA和DERA-MA突变体的活性活性中心的结构（图2b）显示出β1-α2环的构象差异，以及L20从朝内（DERA-WT）向朝外（DERA-MA）位置的位移转变。肉桂醛浸泡的DERA-MA的活性位点（图2c）显示K167与苯亚烯丙基（黄色）的共价席夫碱中间体，同时还显示出D102和K201的保守活性位点残基的侧链。DERA-MA中苯亚烯丙基的结合口袋（图2d）显示出席夫碱中间体和周围残基的侧链。总的来说，DERA-MA的高分辨率晶体结构（结合底物或无底物）揭示了突变体是如何重塑活性位点处底物结合的口袋以容纳α,β-不饱和醛并将其导向保守的催化性赖氨酸，从而形成共价席夫碱中间体。
表1 生物催化剂DERA-MA对映选择性合成γ-硝基醛
（来源：ACS Catal.）
DERA-MA的底物范围
DERA-MA具有广泛的底物范围，可以接受芳香环上各种供电子或吸电子取代的肉桂醛（表1a）。DERA-MA可以接受在邻/间/对位具有吸电子取代基的醛化合物1a−d，以及对于空间上具有严格要求且邻/间/对位具有给电子取代基的醛化合物1e−g（尽管1e−g的活性和立体选择性略微下降）；间位取代的醛1h−j同样可以被 DERA-MA催化。值得注意的是，α,β-不饱和酮1l不能被改造的酶所催化，这说明了DERA-MA偏好催化α,β-不饱和醛发生Michael加成反应。
最后，作者利用DERA-MA以高转化率（89% ->99%）、高选择性（e.r. = 99:1）和较好的分离产率（高达66%）半制备级催化合成了γ-硝基醛R-3a,d,h（表1b）。值得注意的是，R-3a,d,h是具有价值的合成前体，其通过两个简单步骤，可以很容易地转化为具有药物活性的γ-氨基丁酸phenibut、baclofen和fluorophenibut。
综上，这项工作展示了通过定向进化扩大天然醛缩酶的反应范围，使其可用于不对称Michael加成反应，为探索由DERA-MA衍生的催化剂催化亚胺提供了机会。
论文信息：
Unlocking Asymmetric Michael Additions in an Archetypical Class I Aldolase by Directed Evolution
Andreas Kunzendorf,§ Guangcai Xu,§ Jesse J. H. van der Velde, Henriëtte J. Rozeboom, Andy-Mark W. H. Thunnissen, and Gerrit J. Poelarends*
