论文DOI：10.1021/acscatal.1c05306
本文通过设计不同的氢酶-电极界面，分析了电极界面表面电荷、非转化信号、电子转移数和酶构象四者之间的关系，预测了氢酶在不同碳纳米管修饰电极上存在的取向，获得了氢酶与电极最优结合方式，提高了界面电子传递速率。
生物酶-电极界面研究在生物电池、生物传感和生物电合成等方面都有重要的作用。构建高效的酶-电极界面，促进电子传递与传质，设计性能优越的生物电子设备，成为生物电化学系统重要的研究内容。在酶-电极构建过程中，为获得高效生物电子传递，需设计一定的结合驱动力、合理的酶-电极交互方式和稳定的界面微环境。根据Marcus电子传递理论，传递距离和电势差是制约传递速率的重要因素。由于酶分子复杂的表面理化性质和结构组成，研究酶-电极界面上酶与电极的结合方式和互作机制，使酶以特定空间取向固定于电极，对实现高效生物电子传递和提高酶-电极性能具有重要意义。来源于Pyrococcus furiosus胞质可溶性氢酶PfSHI是一个具有高热稳定性的双向氢酶，它由四个亚基组成，即：包含[NiFe]活性中心的大亚基(α)，包含3个铁硫簇的小亚基(δ)，具有两个铁硫簇的亚基(β)和结合了1个FAD和1个2Fe-2S的亚基(γ)。在以往的研究中，PfSHI常用于产氢和再生辅酶。由于其优异的催化活性、稳定性和氧耐受性，PfSHI在构建氢氧燃料电池方面也具有很大的潜能。然而，基于将酶共价结合到碳纳米管上构建成生物燃料电池的阳极，由于PfSHI在电极上随机的取向，电极上酶的有效连接只占总固定酶的10%左右。此外，该四亚基氢酶由于结构复杂，晶体结构尚未被解析，使研究其与电极的界面结合与互作机制变得复杂。本研究对PfSHI酶分子内非匀质电子传递通道和界面间电子传递通道进行不断的深入研究，将酶的活性中心尽可能的接近电极表面。通过理性设计酶-电极界面，研究了酶在电极表面上的多种微观构象，建立了多个酶-电极耦合模型，并对各个模型进行了相关动力学参数的拟合和计算，设计出了最优的一组酶-电极界面和最短的电子传递通路。▲图1. PfSHI/Pristine-MWCNTs/GCE界面电化学表征。a. PfSHI结构示意图。b. 电极在PfSHI电解液中进行连续循环伏安扫描。c. 循环伏安法验证酶电极的非转化信号，左：1-50 圈在含酶电解液中测试，右：1-25 在含有酶的电解液中测试，26-50转移至不含酶缓冲液中。d. PfSHI/Pristine-MWCNTs/GCE形式电位与pH 的线性关系。e. PfSHI/Pristine-MWCNTs/GCE在pH 7.0下的非转化信号。f. PfSHI/Pristine-MWCNTs/GCE在pH 10.0下的非转化信号。
研究中，将PfSHI固定到碳纳米管，获得了其非转化电流信号，通过研究非转化信号形成过程及与pH 之间的关系，验证了酶-电极界面电化学反应是一个质子转移耦合电子转移(PCET)的过程。通过进一步分析PfSHI的结构模型，可知酶与电极界面相交的结构域为γ亚基，其结合辅因子FAD和[2Fe-2S]2+/1+接近于酶表面且能与电极进行电子传递(图1)。▲图2. PfSHI 氢酶γ亚基示意图。a. γ亚基模型。b. PfSHI固定到Pristine-MWCNTs/GCE的微观构象。
通过分析模型可知，FAD和[2Fe-2S]2+/1+都分布在γ亚基的表面附近，所以这两个非转化信号很容易能被检测出来，FAD与[2Fe-2S]2+/1+的距离为12.8 Å，这个距离也能使电子快速从[2Fe-2S]2+/1+传递到FAD(图2)。▲图3. PfSHI在正电(Pos-MWCNTs )和负电(Neg-MWCNTs) 碳纳米管修饰电极表面电化学性质表征。a. Pos-MWCNTs和Neg-MWCNTs结构示意图。b. Pos-MWCNTs和Neg-MWCNTs的Zeta电位分析。c. PfSHI/Pos-MWCNTs/GCE和PfSHI/Neg-MWCNTs/GCE形式电位与pH 的线性关系。d. PfSHI在Neg-MWCNTs (左) 和Pos-MWCNTs (右)上的构象示意图。e. 碳纳米管修饰酶电极界面间电子传递个数。
为了研究静电作用力在酶-电极界面形成过程中发挥的作用，将PfSHI 固定到带正电和带负电的MWCNTs 修饰的玻碳电极上，并对各电极进行了直接电化学表征。通过分析电极界面电极表面电荷、非转化信号、电子转移数和酶构象四者之间的关系，预测了酶在不同带电碳纳米管修饰的电极上存在的不同构象。为了进一步验证，实验对电极的非转化峰进行积分，计算了界面电子转移数，证明了PfSHI在电极上的形态受电极表面静电影响。▲图4. PfSHI修饰电极的氧化催化电流与定向固定。a. 不同pH条件下氧化催化电流。b.氧化电流0 V处DET/MET比值大小与pH值的关系。c. CV 曲线正扫部分动力学拟合结果。d. 三种碳纳米管的水滴角测试亲疏水性。
通过氢氧化电流大小和循环伏安曲线拟合分析，PfSHI/Neg-MWCNTs/GCE和PfSHI/Pos-MWCNTs/GCE的直接/间接催化电流比率和其“S”型曲线都弱于PfSHI/Pristine-MWCNTs/GCE，PfSHI固定到Pristine-MWCNTs/GCE电极上获得了高效的界面电子传递效率。利用水滴角度测量仪对三种碳纳米管的表面亲疏水性进行了测试，Pristine-WMCNTs的疏水性最好，Neg-MWCNTs次之，Pos-MWCNTs的疏水性最差，酶定向固定的比率与三种碳纳米管的直接/间接催化性能一致。因此，疏水电极表面能使PfSHI获得最佳取向，PfSHI分子在电极上的取向和电催化电流是静电作用和疏水相互作用的协同效应。▲图5. PfSHI在电极上定向固定与吸附动力学研究。a. Pristine-MWCNTsox/GCE的电化学表征结果与亲疏水测试。b. PfSHI/Pristine-MWCNTsox/GCE氧化催化循环伏安曲线。c和d.循环伏安法表征酸性环境对酶电极界面的影响。e和f. QCM测试碳纳米管对PfSHI吸附动力学。g. PfSHI 在疏水电极表面吸附示意图。
为了进一步验证疏水作用力对酶的定向作用，对Pristine-MWCNTs进行亲水化处(Pristine-MWCNTsox)。亲水化修饰后的Pristine-MWCNTsox电极酶固定量变化不大，但定向效果变差。另外，酸性条件下，PfSHI/Pristine-MWCNTs电极界面的酶γ亚基与电极相结合的部分会发生结构变形，导致酶电极界面最佳结合损坏，定向固定效果减弱。根据QCM实验结果进行推测，电场作用力下，PfSHI在Pristine-MWCNTs修饰电极的吸附过程分成两个阶段。在电场作用力下，PfSHI在溶液本体中向电极表面靠近，此时酶的排列是无序的；当PfSHI到达电极表面一定距离时，疏水作用力发挥作用，PfSHI分子在γ亚基疏水表面与电极表面疏水作用力的吸引下进行翻转，随后酶在电极上固定，PfSHI分子在电极上最终形成均一构象。针对PfSHI酶结构复杂，难以进行理性设计达到定性固定的问题，本文通过构建不同的酶-电极界面，分别研究了亲疏水作用力、静电作用力、酸碱性等条件下的界面构型，预测了PfSHI-电极界面微观结构，建立了复杂酶-电极界面系统的电化学分析方法，特别是具有多个亚基但没有晶体结构的酶的界面研究方法，并基于电化学相关计算，对分子内电子传递过程和酶表观动力学过程进行了研究，为复杂的酶-电极体系的研究提供了理论基础和实验模型。朱之光，中国科学院天津工业生物技术研究所研究员，博士生导师，中科院人才计划入选者。近年来获得重点研发计划、国家自然科学基金、天津市自然科学基金、中科院重点部署项目等支持。曾在Chemical Reviews、Nature Communications、Angewandte Chemie、ACS Catalysis、Biosensors & Bioelectronics等知名国际学术期刊发表论文50余篇，引用2000余次，h指数19，专利6项。课题组主要利用生物工程、合成生物学和生物电化学的方法和原理，研究生物催化与电子传递相关科学问题。通过酶设计改造、电子传递强化、以及生物-纳米介面调控等策略，构建高效、稳定的生物燃料电池、生物电化学合成、生物传感等生物电能应用系统。课题组长期招聘分子生物学、生物化学、微生物学、生物电化学等背景的工作人员和客座学生，对此方向感兴趣欢迎邮件联系（zhu_zg@tib.cas.cn），https://www.x-mol.com/groups/zhuzhiguang。https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acscatal.1c05306
