近年来，蛋白质化学合成技术飞速发展，为解析和调控系列重大生理过程提供了关键蛋白质原料。目前，主流的人工蛋白合成采用自然化学连接法（native chemical ligation, NCL）将含N端Cys的蛋白片段与含C端硫酯的蛋白片段进行连接，所需的蛋白/多肽片段则可通过固相合成或者重组表达获取。内含肽自剪切或酶催化等技术极大地提高了获取含C端硫酯或其前体——酰肼蛋白片段的效率，但仅限于可溶性蛋白片段，应用门槛较高。因此，开发更具普适性、可在变性条件下获取含C端酰肼/硫酯蛋白片段的方法引起了科研人员极大的研究兴趣，半胱氨酸侧链巯基氰基化介导的肼解便是其中最为有效的方法之一。然而该方法的核心——半胱氨酸氰基化，并无位点选择性，使其难以适用于含半胱氨酸的目标蛋白片段，严重地限制了其应用范围。
近日，华南理工大学化学与化工学院何春茂教授团队为实现区域选择性的半胱氨酸氰基化，提出了可逆正交保护半胱氨酸的设想，于目标蛋白的C端引入特异性识别标签，并使其满足三个条件：1）N端为Cys以实现无痕肼解剪切；2）能在变性条件下实现特异性可逆结合；3）氨基酸序列较短以避免影响目标融合蛋白的表达。多肽序列CCXXCC可特异性结合双砷染料分子FlAsH-EDT2，已被广泛地用于分子生物学研究。受此启发，团队发展了一种CCPGCC标签介导的选择性氰基化—肼解—蛋白连接的新方法（tetracysteine enabled protein ligation, TCEPL)。
具体而言，依次加入FlAsH-EDT2和2-溴苯乙酮（PacBr）可实现对目标蛋白CCPGCC序列与其它Cys的正交保护，接着一锅加入过量的1，2-乙二硫醇（EDT）以脱除FlAsH，将CCPGCC的巯基暴露。随后加入氰基化试剂2-硝基-5-硫氰基苯甲酸（NTCB）以实现一锅氰基化—肼解，获得蛋白酰肼。待NCL完成后，一锅加入锌粉和3-巯基丙酸（MPA）以脱除Pac基团，即可获得完整蛋白。整个过程仅需三步液相纯化，可实现较大的蛋白合成收率。 何春茂教授团队首先在模型肽段上探索实现了TCEPL策略，并以此完成了含53个氨基酸的铁硫蛋白rubredoxin的半化学合成。随后，对含207个氨基酸的基质金属蛋白酶MMP-14进行了高效制备，并验证了其酶催化活性。最后，团队还将此策略应用于类泛素蛋白UBL5的C端标记，展现了方法优异的多样性和适用性。总之，TCEPL策略克服了当前表达蛋白连接技术的一些主要瓶颈限制，丰富了蛋白质人工合成的工具箱，为获取序列更长的（修饰）蛋白质提供了新的技术手段。 论文信息： Protein Ligation and Labeling Enabled by a C-Terminal Tetracysteine Tag Zeyuan Mo,Shaomin Lin,Wentao Chen,Chunmao He Angewandte Chemie International Edition DOI: 10.1002/anie.202115377
