为了应对SARS-CoV-2更具传染性或侵袭性的变体，需要开发可以被快速调整的抗病毒药物。SARS-CoV-2是一种正链单链RNA病毒，它通过人血管紧张素转换酶2（hACE2）受体进入宿主细胞。病毒RNA基因组需要被不断复制以组装成新的病毒颗粒。此外，病毒基因组RNA会被复制成亚基因组mRNA（sgmRNA），用于病毒蛋白的合成。因此，在病毒感染期间，会产生两种类型的单链RNA，基因组RNA和sgmRNA。原则上，小干扰RNA（siRNA）可同时靶向这两种mRNA，实现双重基因沉默。因此，基于siRNA的病毒mRNA降解可根据突变体的基因序列做出快速调整。因此，德国慕尼黑大学的Thomas Carell教授和Oliver T. Keppler教授课题组提出了基于siRNA降解SARS-CoV-2策略。

该研究评估了一系列siRNA对多种新冠病毒突变体的抗病毒活性。其中，2'-OMe修饰的siRNA同时具有血清稳定性和抗病毒活性。作者进一步通过点击化学反应，将siRNA与肽配体（hACE2为受体）进行缀合，实现了细胞类型特异性靶向的抗病毒功效，能够有效抑制3D肺粘液纤毛肺微组织中的病毒复制和病毒诱导的细胞凋亡。

首先，为了探究基于siRNA的SARS-CoV-2病毒mRNA降解的可行性，作者分析了病毒的基因组结构，并针对病毒RNA不同靶区域设计了几种siRNA（L1、R-2 to R-5、S-6 to S-9）。其中，靶区域分别为5'-前导序列（L）、RNA依赖RNA聚合酶（RdRp，又称Nsp12）编码区和S蛋白编码区（图1a）。所有siRNA在各自的3'末端包含两个2'-脱氧胸苷核苷酸，以增加抗核酸外切酶降解的稳定性。作者首先在人肺腺癌细胞系A549中评估了所设计的siRNA的功效，检测到siRNA L-1（靶标：L）、R-2和R-5（靶标：RdRp）和S-6（靶标：S）的基因沉默效率在80%和92%之间（图1b）。在最初的预筛选之后，作者在Vero-E6细胞（感染B.3穿山甲谱系的SARS-CoV-2分离株）评估了这4种siRNA中的抗病毒效果。测定结果进一步确认了siRNA R-2和S-6高效的抗SARS-CoV-2活性（图1c，d）。当病毒感染前1 h转染细胞时，siRNA R-2和S-6将病毒载量降低高达96%（图1c），当病毒感染后1 h转染细胞时，病毒载量降低高达99.95%（图1d）。基于这些结果，作者选择siRNA R-2和S-6进行进一步研究（图1e）。

为了获得更详细的功效数据，作者建立了一种测定方法，可以在高动态范围内量化SARS-CoV-2诱导的细胞毒性。作者使用MDA-MB-231-hACE2细胞，该细胞过表达hACE2受体，这使细胞极易感染SARS-CoV-2。接下来，作者使用SARS-CoV-2（B.1.177 穿山甲谱系，20E.EU1）感染靶细胞MDA-MB-231-hACE2。数据显示，与siRNA R-2或S-6相比，非靶向乱序siRNA Ctrl.-10转染的细胞活力明显降低（图1f）。在使用MDA-MB-231-hACE2的测定中，siRNA R-2和S-6预处理可保护细胞不被VoCs Alpha（B.1.1.7，图1g）和Beta（B.1.351，图1h）感染致死。值得注意的是，siRNA R-2和S-6的组合特别有效（图1f-h）。

接下来，作者使用SARS-CoV-2 VoC Delta（B.1.617.2，图1i）测定了siRNA S-6的抗病毒作用。这里检测到S-6的活性丧失与第21618位已知的C到G点突变一致，该突变直接位于siRNA的结合靶区域中。当将S-6与R-2结合使用时，活性损失可以得到部分补偿，但无法恢复至最大活性，这表明siRNA结合区域的突变对抗病毒活性产生了显著影响。为了证明基于siRNA的策略可以快速适应病毒突变，作者调整了S-6序列（S-6δ）以对应VoC Delta中的突变，与预期一致，S-6δ重新具备了抗病毒活性（图1i）。这一结果证明了基于siRNA治疗药物的快速适应性。

所有临床使用的基于siRNA的治疗剂都具有修饰的核苷，在靠近硫代磷酸酯的位置带有2' OMe或2' F取代基，从而增加对人血清核酸内切酶的抗性（图2a）。作者制备了完全修饰的siRNA S-6^fm（图2b）。然而，在随后的功效研究中观察到完全修饰的siRNA基因沉默能力降低了40%（图2b）。因此，作者筛选了具有不同修饰的siRNA的抗病毒活性，发现部分修饰的S-6（只有四个2'-OMe修饰，S-6^m），在血清中具有所需的稳定性，并且同时保留了抗病毒活性（图2c-d）。作者进一步对部分修饰的siRNA S-6^m的活性进行了定量评估。结果显示，用S-6^m预处理可在siRNA浓度低至2 nM时防止细胞死亡（图2e)。重要的是，S-6^m在2 nM和0.2 nM时与未修饰的S-6相比具有更好保护作用（图2f）。

为了探究是否可以在没有转染剂的情况下，将siRNA递送到肺微组织中，作者使用受体配体对siRNA进行了化学修饰，预期siRNA-配体缀合物将有助于细胞递送。对于siRNA修饰，作者使用了高效且温和的Cu(I)催化点击化学，借助炔烃与叠氮的反应，将siRNA的正义链连接到已知与hACE2受体相互作用的短肽上，作为SARS-CoV S蛋白受体结合域的一部分（图3a）。通过MALDI-TOF质谱分析证实了肽-siRNA偶联物S-6^m-P sense的成功合成后，将S-6^m-P sense链与相应的S-6^m antisense链杂交，得到肽修饰的siRNA嵌合体S-6^m-P。实验结果观察到了siRNA被摄取到Caco-2细胞中，这种摄取依赖于siRNA与肽的缀合（图3b）。然而，与基于脂质转染的递送相比，肽介导的siRNA摄取到细胞中的效率要低得多。

接下来，作者探究了肽修饰的siRNA（S-6^m-P）是否可以阻止SARS-CoV-2在人类3D粘液纤毛肺EpiAirway微组织中的复制。结果观察到，siRNA肽嵌合体S-6^m-P对SARS-CoV-2的抑制作用与临床药物瑞德西韦（RDV）相当（图3c）。此外，S-6^m-P能够有效抑制四种病毒转录物（sgmRNAs）在感染的细胞中合成，这四种病毒转录物分别对应了核衣壳蛋白（N）、刺突蛋白（S）、膜蛋白（M）和小膜蛋白（E）（图3d）。随后，作者进行了RNA荧光原位杂交，以进一步量化肺微组织中的SARS-CoV-2阳性细胞。结果观察到S-6^m-P预处理后，感染细胞的数量明显减少（图3e、f）。重要的是，在未经处理的SARS-CoV-2感染组织中检测到了病毒诱导的细胞凋亡，但在用S-6^m-P或RDV预处理后未检测到（图3g），这些数据证明了S-6^m-P的有效性。

然而，作者注意到尽管对肺微组织进行了siRNA处理，但通过RT-qPCR在上清液中仍可检测到病毒的存在（图3c）。为了进一步验证，作者重新研究了使用siRNA S-6^m和lipofectamine转染的病毒滴定实验。虽然细胞活力数据表明，在感染后72 h完全抑制病毒复制（图4a），但相比之下，残留的病毒仍可通过RT-qPCR检测到（图4b），S-6^m和Ctrl.-10之间Ct值差异较小。为了排除可能的由引物特异性造成的差异，作者使用RdRp、E和M基因靶向引物进行了额外的PCR定量，并观察到S-6^m对S基因的影响最强（图4c）。基于这些结果，作者假设S-6^m诱导了高度特异性的病毒RNA降解，但仅限于siRNA靶向区域。作者推断这可能导致缺乏S蛋白的缺陷病毒颗粒的分泌，因此这些缺陷病毒颗粒是非传染性的。为了验证这一假设，作者进行了上清液转移实验，其中siRNA预处理的SARS-CoV-2感染的A549-hACE2细胞的培养上清液用于攻击MDA-MB-231-hACE2细胞（图4d）。结果表明，R-2、S-6^m、特别是R-2+S-6^m处理的A549-hACE2细胞的上清液，没有显示出SARS-CoV-2感染并释放传染性病毒颗粒的证据（图4e）。这些数据表明，基于PCR的抗病毒作用分析确实低估了siRNA的抗病毒作用。这一结果对于未来抗病毒siRNA的开发具有重要意义。

总的来说，该研究基于siRNA降解SARS-CoV-2策略的优势在于它的灵活性，如果病毒靶RNA序列发生突变，则可以快速调整相应的siRNA。此外，该策略还允许同时靶向多个病毒基因组位点。由于Omicron VoC (BA.1)与Alpha和Beta VoC基因组序列相似，Omicron VoC (BA.1)变体在本研究所靶向的RNA区域未发生突变，作者预计此处报道的siRNA序列在该变体上也具有活性。