蛋白质是生命功能的执行者，因此对感兴趣的目标蛋白进行标记具有重要意义。已经发展的各种蛋白标记技术在生物成像、蛋白质纯化和功能探究、蛋白质组学等多领域发挥着重要作用。其中，自标记蛋白标签系统只需要将标签蛋白与目标蛋白进行简单的融合表达，然后通过标记能特异性识别标签蛋白的配体小分子，即可实现目标蛋白的标记。自标记蛋白标签系统使用方便，配体小分子能偶联多种功能化分子，可以轻松实现对目标蛋白的靶向、富集和成像等。目前已经发展出以 HaloTag和SNAP-tag为典型代表的多种蛋白标签，它们各具特色，广泛服务于生物研究。此外，随着现代超分辨成像技术的不断发展，新的成像技术对染料也提出了更高要求，传统的荧光蛋白标记受限于亮度及波长难以满足超分辨显微成像需求，而拥有更高亮度更广波长范围的小分子染料则十分合适，这也使得能利用上小分子染料的蛋白标签技术在这一领域拥有独特优势。发展更多好用的蛋白标签，不仅能为蛋白标记提供更多选择，也能大大助力多色细胞成像。

近日，北京大学未来技术学院分子医学研究所、北大-清华生命科学联合中心陈知行课题组发展了第三代基于甲氧苄啶的共价蛋白标签技术TMP-tag3，相比于第二代TMP-tag，TMP-tag3具有更短的linker能实现更快速的共价蛋白标记，在偶联新型荧光染料时，活细胞标记速率和标记亮度均显著提升。该研究还将TMP-tag3与目前广泛使用的HaloTag和SNAP-tag在标记动力学、标记后蛋白定位、标记蛋白loop区等方面做了详细比较，最后将三种蛋白标签联合用于多色超分辨成像，实现了多种蛋白标签技术的正交活细胞标记与成像。

相比于第二代TMP-tag，第三代TMP-tag的小分子结构更简洁、合成更方便，因为分子整体更亲脂，拥有更优越的进细胞速率。偶联目前常用的具有荧光发生(fluorogenic)性质的罗丹明染料SiR、MaP555时，能对不同定位的各种目标蛋白H2B、actin、MAP7、Tomm20等成像。

HaloTag和SNAP-tag是目前使用最为广泛的两种蛋白标签，研究人员使用高内涵成像系统高通量地评价了HaloTag、SNAP-tag和第三代TMP-tag活细胞标记的速率和亮度。研究发现，当偶联染料SiR时，TMP-tag标记速率略逊于HaloTag，饱和标记亮度相当，且此两种tag均明显优于SNAP-tag。当偶联染料MaP555时，HaloTag的标记优势更明显，但TMP-tag相比于SNAP-tag仍有更快的标记速率。

标记后对目标蛋白定位的影响也是评价不同蛋白标签的重要指标之一，相比于HaloTag（36kD）和 SNAP-tag (19 kD)，TMP-tag的标签蛋白eDHFR (18 kD)最小。蛋白标签和目的蛋白的融合最终定位一方面受信号肽介导，另一方面是标签蛋白和目的蛋白之间的较量，当标签蛋白占主导地位时，融合后可能导致错误的细胞定位。研究发现，在标记只有几十个氨基酸的小蛋白时，TMP-tag更有优势。在标记线粒体内膜蛋白COX8A和ATP5ME时，TMP-tag和 SNAP-tag均能实现正确的线粒体定位的标记，而HaloTag则需要融合多次重复的目标蛋白序列才能实现正确定位。

蛋白标记大多位于N端或C端，但当N端或C端有生物学功能或者是被包被的时候，蛋白loop区的标记显得尤为重要。eDHFR相比于HaloTag（32.5 Å）和 SNAP-tag（39.6 Å）N-C 端距离小，仅为14.2 Å，在插入目标蛋白loop区时对目标蛋白影响最小。研究人员分别在firefly luciferase和sfGFP的loop区插入三种标签蛋白，结果均为eDHFR对目标蛋白的表达和功能损伤最小。之后，为了在活细胞上验证eDHFR作为loop fusion优选蛋白标签的能力，本研究在多巴胺受体DRD1的loop区融合表达eDHFR后进行活细胞成像，细胞成像表明融合蛋白显示正确的细胞膜定位。

最后，研究人员用第三代TMP-tag、HaloTag和SNAP-tag分别偶联不同波长染料，成功实现了双色及多色超分辨STED成像。这表明TMP-tag3作为新一代蛋白质标记工具，可以与现有的HaloTag，SNAP-tag系统进行正交联用，从而同步观察多个细胞结构和蛋白质间的相互作用及动态变化，预示着面向未来成像组学“4D Cellular Physiology”新需求的TMP-tag3将在研究生物体生理病理过程中发挥重要作用。

总之，本研究发展了标记速率更快、更适用于活细胞成像的新一代TMP-tag，其标签蛋白小、N-C端距离近的独特优势，使TMP-tag更适合于小蛋白和蛋白loop区的标记。TMP-tag丰富了蛋白标签技术，为不同的标记需求提供了新选择，同时正交标记的策略实现了活细胞多蛋白多色成像。Tag和染料的不断共同进化，也将成为未来活细胞成像标记的发展方向之一。