二萜类天然产物是萜类家族中结构多样性最强的一类化合物（已发现大约18000个），且具有多种生物活性。这类化合物的化学骨架多样性主要归功于二萜环化酶的催化，该类酶可以将20个碳原子的通用线装底物GGPP转化成各种富含手性中心和环系结构的二萜产物。然而，相对于二萜类化合物的大量发现，二萜环化酶的结构和催化机制研究大为滞后，尤其是对它们如何催化产生多环二萜的理解比较欠缺。 近日，北京大学药学院马明研究团队与德国波恩大学Jeroen S. Dickschat教授合作，通过解析二萜环化酶晶体结构揭示复杂四环二萜cattleyene生物合成机制，并基于晶体结构开展定点突变改变酶的产物结构，获得新骨架二萜化合物。 Cattleyene（1）是一个新骨架的四环二萜，具有不同于其它二萜化合物的5/5/6/5环系结构。研究团队针对cattleyene的二萜环化酶CyS开展了研究，解析了CyS的母体晶体结构（2.00 Å）、CyS与原始底物GGPP的复合物晶体结构（1.87 Å）。该复合物晶体结构首次揭示了原始底物GGPP在二萜环化酶活性口袋中的结合信息，不同于文献报道中的GGPP类似物的结合信息。进一步深入分析发现CyS活性口袋中的多个芳香性氨基酸可以通过cation-π相互作用稳定碳正离子中间体，分子对接实验揭示了CyS从结合GGPP到生成cattleyene的完整环化过程。
图1. 四环二萜cattleyene的结构、二萜环化酶CyS晶体结构，以及GGPP在CyS中的结合 研究团队开展了定点突变研究，验证了CyS活性口袋中的关键氨基酸残基的功能。关键残基的突变导致无法稳定碳正离子中间体，使得生物合成流向上游旁路路径，产生不同骨架的二萜产物。出乎意料的是，一个远离GGPP结合口袋的突变C59A除了产生cattleyene外，还产生了5个不同环系新产物（化合物2-5）。研究团队进而解析了CySC59A突变体的晶体结构（2.30 Å），揭示了半胱氨酸C59虽然不与底物GGPP直接相互作用，但是其突变为丙氨酸后空间位阻减小，松弛了活性口袋，使得突变后的酶能够更快地结合底物并催化反应，但同时失去了只产生cattleyene一个产物的专一性。 图2. CyS定点突变产生不同骨架的二萜产物 鉴于突变体产物化合物6是一个新骨架四环二萜，它的环化机制无法通过经验进行简单的推测，因此研究团队通过一系列13C 和2H的同位素标记实验，揭示了化合物6形成中所经历的多种骨架重排和氢负离子迁移的过程。 该研究不仅推进了对四环二萜环化酶催化机制的理解，也为复杂环系二萜的合成生物学制备提供了依据。 论文信息 Crystal Structure Based Mutagenesis of Cattleyene Synthase Leads to the Generation of Rearranged Polycyclic Diterpenes Baiying Xing, Houchao Xu, Annan Li, Tingting Lou, Meng Xu, Kaibiao Wang, Dr. Zhengren Xu, Prof. Dr. Jeroen S. Dickschat, Dr. Donghui Yang, Dr. Ming Ma Angewandte Chemie International Edition DOI: 10.1002/anie.202209785
