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Angew. Chem. :新型生物传感器耦合微液滴高通量筛选技术实现酮糖3-差向异构酶的高效催化

D-阿洛酮糖(D-allulose)是一种理想的低能量甜味剂替代品,同时其具有许多优良的生理功能。生物酶法合成D-阿洛酮糖主要通过酮糖3-差向异构酶(KEase)特异性地在D-果糖C3位进行差向异构,具有高特异性、高催化活性等优势,在D-阿洛酮糖的生产应用中得到广泛认可。然而,目前已报道鉴定的该家族酶在工业生产条件下催化活性不足且耐受性差,严重阻碍了其在生物转化中的广泛应用。因此,开发高活性、高耐受性的KEase是实现D-阿洛酮糖工业化生产的关键。


近期天津科技大学秦慧民团队设计并优化了可响应D-阿洛酮糖的生物传感器系统,进一步耦合KEase表达系统实现了目标酶催化活性与宿主菌荧光信号的关联。借助液滴微流控平台高效的筛选能力,结合上述体内的酶筛选传感器系统,本研究构建了KEase酶的微液滴高通量筛选策略:1)目标酶突变体库的构建;2)突变体库单细胞及相关试剂液滴共包裹;3)单细胞液滴室温培养;4)基于液滴内细胞荧光信号的的液滴分选,收集阳性液滴;5)回收阳性变体,进行活性分析。



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图1. 基于生物传感器的微液滴高通量筛选策略

本研究以来源于Sinorhizobium fredii CCBAU 83666的D-阿洛酮糖3-差向异构酶(SfDAE)为研究对象,通过蛋白晶体结构衍射获取酶分子结构信息,鉴定酶分子催化活性口袋重要氨基酸位点(催化残基、金属离子结合残基),同时运用结构生物学和分子动力学模拟手段首次解析了该家族酶位于底物结合口袋处的高灵活性盖子结构,并揭示了其在底物进入酶活性口袋的过程中发挥着至关重要的调控作用。

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图2. SfDAE结构分析及分子动力学模拟

利用上述微液滴高通量筛选策略,基于结构信息进行酶分子设计,优化活性中心及高灵活盖子区域关键氨基酸残基,同时结合定向进化理论从酶分子全局出发进行高通量定向筛选,在维持其高热稳定性的同时,将SfDAE的催化效率提升了17倍。基于结构分析及分子动力学模拟,揭示突变体中突变的引入重塑了酶分子活性位点的结构构象,同时改善了盖子区域的灵活性及摆动范围,阐明了酶分子催化效率提升的机理。

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图3. 基于结构的SfDAE理性设计及定向筛选

本工作设计并优化了基于生物传感器的微液滴高通量筛选系统,以作为一种低成本、高通量的酶筛选工具,用于定向进化KEase及其他D-阿洛酮糖转化相关酶。基于结构的理性设计及定向进化,结合上述微液滴高通量筛选,开发高性能KEase,用于D-阿洛酮糖的高效合成。本研究对D-阿洛酮糖转化相关酶的功能改造具有指导意义,同时为酶功能改造提供一种高效筛选的新方法。

文信息

Substantial Improvement of an Epimerase for the Synthesis of D-Allulose by Biosensor-Based High-Throughput Microdroplet Screening

Chao Li, Xin Gao, Hongbin Qi, Wei Zhang, Lei Li, Cancan Wei, Meijing Wei, Xiaoxuan Sun, Shusen Wang, Liyan Wang, Yingbin Ji, Shuhong Mao, Zhangliang Zhu, Masaru Tanokura, Fuping Lu, Hui-Min Qin


Angewandte Chemie International Edition

DOI: 10.1002/anie.202216721




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