NADH诱导的“启动”荧光探针验证氧化还原调节剂GSH的串扰-上海纳孚生物科技有限公司

分享一篇发表在Sensors and Actuators B: Chemical上的文章，题目是“NADH- induced “kick-on” fluorescent probe validates crosstalk with redox regulator GSH”，文章的通讯作者为JIS Institute of Advanced Studies and Rsearch的Sankarprasad Bhuniya副教授。

氧化还原偶对1,4-二氢烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH/NAD+)是真核细胞中普遍存在的电子转运体。NADH作为中心代谢过程的辅酶，通过三羧酸循环(TCA)、糖酵解和戊糖磷酸途径将碳源转化为各种分子前体。代谢通量严格控制NADH/NAD+的比例，以完成各种代谢和分解过程，将不同的大分子转化为能量。然而，NADH水平的升高会扰乱多种代谢过程，从而可能引发ROS的形成、DNA损伤和癌症转移此外，高糖酵解通量提高了NADH水平，维持了癌细胞增殖过程中对能量的高需求。因此，通过开发合适的激动剂或拮抗剂，操纵NADH水平可以成为停止各种代谢紊乱和癌症生长的独特解决方案。为此，需要一种有效的工具来评估单个细胞中NADH的表达，而不损害任何健康细胞；这将是化学选择性的，能够提供准确的信息，而不会受到活细胞中其他反应性时间物质的干扰。有几种方法，如电化学，酶测定等，用于跟踪活细胞中的NADH。除此之外，高灵敏度的荧光吸引策略材料，如小分子荧光探针、基因编码蛋白和纳米颗粒已被用于跟踪活细胞中的NADH。最近，基于“推池”机制的几种荧光探针被用于跟踪活细胞中的NADH。一项新的研究表明，氧化还原偶、GSH/GSSG和NAD+/NADH的失衡改变了氧化还原稳态，加速了生理性ROS的形成；这会引起各种生理障碍，如中风、血脂异常、糖尿病、高血压等。因此，我们有兴趣研究氧化还原对、NAD+/NADH和GSH/GSSG之间是否存在注释效应；这可能为开发针对ROS诱导的致病性疾病的合适拮抗剂打开了新的窗口。因此，需要一种新的荧光探针，它可以合成简单，并且可以在活细胞中快速精确检测NADH。本文主要讨论探针PNADH的合成路线、在NADH存在下其紫外可见光谱和荧光光谱的变化、荧光成像对活细胞中NADH的跟踪以及与氧化还原调节剂GSH的串扰。

为了证实我们的观点，我们合成了一种新的开启探针PNADH(方案1)来验证活细胞中NADH的表达水平。

方案1. 荧光探针PNADH的合成及其在NADH存在下的分解。

在该策略中，NADH还原了PNADH中喹啉C4上的芳π键，促进了不稳定碳酸盐键的自烧裂解，释放荧光团(FL)(方案1)。首先，我们评估了用不同浓度的NADH (0 ~ 400 μM)滴定探针PNADH检测NADH的效价。探针PNADH在以552 nm为中心的荧光强度随NADH的剂量线性增加，且呈良好的线性关系，系数(R)为0.987(图1a)。此外，在时间依赖性荧光研究中(图1b)；我们注意到~ 40分钟后在400 μM NADH存在下，PNADH完全转化为FL。NADH催化PNADH生成FL的时间依赖性也与时间保持良好的线性关系(R = 0.997)。由回归方程得到的NADH计算值表明，探针PNADH可以检测到最小1.25 μM的NADH。

图1. a) pH 7.4时，PBS缓冲液(0.5% DMSO)中，用NADH (0 ~ 400 μM)滴定PNADH (5 μM)的发射光谱。b) PBS缓冲液(pH = 7.4)不同时间尺度(0 ~ 60 min)下PNADH (5 μM)与NADH 400 μM的荧光强度变化。

此外，我们使用Michaelis-menten和LineweaverBurk方程，通过确定动力学参数，如Michaelis常数(KM)、催化效率常数(k_cat/KM)和周转数(k_cat)，估计了PNADH和NADH之间的催化反应效率。KM、k_cat和k_cat/KM的取值分别为37.72 μM、0.31 s⁻¹和8.218 × 103 M⁻¹ s⁻¹(图2)。较高的k_cat/KM值表明PNADH是检测NADH的良好候选。

图2. a)不同PNADH浓度(0 ~ 20 μM)下100 μM NADH在552nm处随时间变化的发射强度增量。b) Michaelis-Menten阴谋。c) NADH对PNADH还原的Lineweaver - Burke图。d)在PBS缓冲溶液(0.5% DMSO)中，pH为7.4,100 μM的NADH在37°C下孵育60 min后，荧光强度与不同浓度的PNADH (0-20 μM)的关系。

为了验证探针PNADH在活细胞中跟踪NADH表达的能力，我们在时间依赖性研究中(图3)，观察到PNADH能够在15分钟内提供HeLa、MDA-MB 231和WI-38细胞的绿色通道图像。之前Tang等人报道探针仅在10分钟内提供图像。这一发现表明该探针具有高度的细胞膜渗透性，并且对NADH具有反应性，可以避免活细胞中其他类似反应物质的干扰。此外，在剂量依赖性研究中，我们观察到细胞标记程度随着PNADH剂量(0-20 μM)的增加而增加(图4)；这显然是因为PNADH与细胞NADH之间的反应程度更大。

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