分享一篇近期发表在Nature Communications上的文章，题目为“Location-agnostic site-specific protein bioconjugation via Baylis Hillman adducts”。文章的通讯作者为印度博帕尔科学教育与研究所的Dimpy Kalia。
蛋白质N-末端半胱氨酸（N-Cys）独特的反应性对选择性蛋白质标记具有重要意义。此前，作者报道了衍生的Baylis Hillman加合反应与1,2-氨基硫醇之间的快速选择性反应，以形成双杂环支架，并将其用于体外和活细胞条件下稳定的蛋白质生物偶联。作者将这种蛋白质生物偶联技术称为Baylis Hillman orchestrated protein aminothiol labelling （BHoPAL）。此外，作者还报道了一种基于硫辛酸连接酶的技术，用于在蛋白质内任意位点引入1,2-氨基硫醇部分，使 BHoPAL技术应用不局限于N-Cys，从而与位置无关。将这种方法与BHoPAL联用，生成了双标记的蛋白质生物偶联物，即在单个蛋白质分子的两个不同特定位点上附加了不同的标记（图1）。
图1. 用于蛋白质中1,2-氨基硫醇化学选择性生物偶联的BHoPAL（Baylis Hillman orchestrated protein aminothiol labelling）策略。
靛红衍生的 Baylis Hillman（IBH）反应已被用作合成复杂天然产物的支架、医药中间体和临床药品的研究，尽管对IBH进行了广泛的研究，但它们与1,2-氨基硫醇的反应性尚未报道。作者设想IBH中有两个适当定位的离去基团，一个α-乙酸基团和一个β-氰基团，将与1,2-氨基硫醇进行两次连续的加成-消除反应，以生成6元环状加合物（图2）。该反应将涉及初始硫醇添加，然后消除乙酸盐以生成中间体 B，然后进行分子内氮杂-迈克尔加成，然后消除氰基形成2，由于分子内2中的烯烃将被锁定在Z构象中，使该反应具有高度的Z选择性（图 2）。作者合成了N-乙酰的IBH加合物1并在碱性条件在室温下，在质子有机溶剂和非质子有机溶剂以及水溶液中反应，验证了上述假设。
图2. 通过IBH加合物介导的1,2-氨基硫醇衍生化合成C=C连接的双杂环。
首先，作者用N -酰基IBH加合物1A和1B在不同pH条件下用等摩尔量的半胱胺·盐酸处理，在高pH条件下反应的更快(图3a)。用烷基取代N -酰基会减慢与N -甲基加合物1c的反应。接下来，作者研究了从n -乙酰半胱氨酸(NAC)开始的20种蛋白质原氨基酸对1,2氨基硫醇片段的选择性，均具有不错的产率(图3b)， N-甲基加合物1C也得到了类似的结果。基于半胱氨酸和1A在pH值为6、7、7.5和8的水溶液中的反应的紫外光谱的动力学分析，计算出他们的二级速率常数 (图3c)。建立了BHoPAL对1,2-氨基硫醇的优异化学选择性。
图3. 水溶液条件下N -酰基/烷基IBH加合物与半胱氨酸的快速定量偶联。
接下来，作者使用BHoPAL标记蛋白质的N-Cys残基。构建了三种N-Cys模型蛋白的，增强型绿色荧光蛋白(eGFP)、麦芽糖结合蛋白(MBP)和mCherry，通过重组生产这些蛋白，将它们融合到烟草蚀刻病毒(TEV)蛋白酶底物肽(ENLYFQC序列)的N端，并进行TEV蛋白酶裂解(图4)。用等量的N -乙酰基IBH加合物1A、1D和1E在pH 6.5的磷酸钠缓冲液中处理所得的N-Cys蛋白，通过ESI-MS分析，所有9种蛋白偶联物均可得到，产率高达99%(图4)。这些结果确定了对蛋白质内部半胱氨酸的N-半胱氨酸的选择性。作者发现蛋白质生物偶联物是稳定的，并保留了未修饰的前体蛋白的结构和功能特性。这些结果表明，在温和的生物相容性条件下，BHoPAL在低试剂浓度下快速定量进行，而不会破坏蛋白质结构和功能以形成稳定的蛋白质偶联物。
图4. 通过BHoPAL标记含N-Cys 的蛋白质。
