位点特异性的硫-芳基化生物偶联反应用于生成酪氨酸类似物的抗体前药制备-上海纳孚生物科技有限公司

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J. Am. Chem. Soc. | 位点特异性的硫-芳基化生物偶联反应用于生成酪氨酸类似物的抗体前药制备

为大家介绍的是最近在Journal of the American Chemical Society 上报道的一篇标题为 “Site-Specific Antibody Prodrugs via S‑Arylation: a Bioconjugation Approach Toward Masked Tyrosine Analogues” 的文章。该文的通讯作者是麻省理工学院化学系的Stephen L. Buchwald教授、Bradley L. Pentelute教授和百时美施贵宝研发部门的Yong Zhang。本文开发了一种抗体前药的设计方法，能够在目标抗体的互补决定区中引入掩蔽基团以减少抗体在正常组织中的脱靶毒性。并能在特定条件下脱保护变为一种酪氨酸模拟物，羟苯基半胱氨酸，基本维持原抗体的抗原结合活性。

抗体在包括癌症在内的多种人类疾病的治疗中有着里程碑式的应用意义，尤其是近年来逐渐兴起的肿瘤免疫疗法。细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4（CTLA-4）在T细胞的识别和免疫抑制过程中起到重要作用，是肿瘤细胞逃逸免疫系统杀伤的重要受体之一。用抗体来阻断CTLA-4与其配体的相互作用能够激活免疫系统，并允许T细胞杀死相关的细胞。然而，与许多抗体治疗药物一样，这一靶蛋白存在于病变和健康组织中，这可能通过与非肿瘤相关的CTLA-4相互作用导致肿瘤外毒性。因此，利用抗体前药的策略，使抗体在目标区域的刺激条件（如蛋白酶表达）下激活并恢复抗原结合能力，能够有效降低其毒性，并扩大治疗窗口。

现有的抗体前药制备策略主要集中于通过融合表达的方式在抗体的N端或C端添加掩蔽组件，但这种策略只将可掩蔽残基限制在20种天然氨基酸中。在抗体侧链进行修饰能够更有效地阻断其与抗原的结合，并且能够广泛添加反应位点，使响应类型多样化。此前作者团队研究过钯催化的半胱氨酸芳基化反应，并且验证了产物与酪氨酸结构和功能上的相似性。因此，在本文中，作者以CTLA-4的FDA批准抗体药物伊匹木单抗作为研究对象，用钯催化的氧化加成反应在其半胱氨酸侧链上引入功能化芳基，实现了用蛋白酶可切割序列连接的PEG链对抗体结合能力的掩蔽。 (图1)

图1. 通过半胱氨酸的钯催化芳基化偶联获得抗体前药的方法。

首先，作者团队尝试在伊匹木单抗的侧链上突变酪氨酸为半胱氨酸，在这些半胱氨酸上用优化的流程开展钯催化的氧化反应，成功在Y32C和Y49C两个位点上引入了芳基连接子。经过纯化，质谱结果证实了芳香连接子被添加在了轻链而非重链上，而且MS/MS二级质谱结果也证明了在半胱氨酸残基的位置有唯一的修饰。并且该羟苯基半胱氨酸（HPC）突变的伊匹木单抗与野生型的抗体有相当的抗原结合能力。(图2)

图2. 钯催化的半胱氨酸芳基化特异性地发生在引入半胱氨酸残基的伊匹木单抗上，具有良好的转化率。

在验证了该反应能够在伊匹木单抗上引入HPC保护基后，作者团队开始研究通过这个反应引入掩蔽基团的可能性。最终选择能够通过空间效应减少结合，并增加蛋白血清半衰期的聚乙二醇作为掩蔽基团。他们通过四步合成了带有5k分子量PEG和LSGK间质蛋白酶（Matr）酶切序列的钯氧化加成复合物。通过SDS-PAGE验证了轻链上聚乙二醇的成功偶联以及在Matr处理下的成功脱笼。(图3)

图3. 利用聚乙二醇掩蔽基团遮盖伊匹木单抗的抗原结合活性并实现肿瘤特异性酶切脱笼。

接下来，作者团队进行了初步的细胞实验，以说明PEG-HPC成功掩蔽了抗体与抗原的结合作用。通过FACS验证了与Jurkat细胞的结合，发现经过掩蔽，其结合效力下降了约47倍，而酶切脱笼后则基本恢复野生型水平。SPR结合能力测定也佐证了PEG有强效的掩蔽作用，证明了在抗体前药的制备过程中，大位阻基团的掩蔽是有效的。(图4)