SPIDERTM. 邻近标记 DNA Pull-Down 试剂盒-上海纳孚生物科技有限公司

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SPIDERTM. 邻近标记 DNA Pull-Down 试剂盒

一、产品简介

邻近标记技术已被成功应用于鉴定蛋白靶标,相比传统的Pulldown/IP+MS技术,邻近标记技术可以解决鉴定弱或瞬时相互作用、研究膜蛋白等诸多问题。根据结核分枝杆菌类泛素蛋白酶体系统中底物Pup分子在体外能够招募PafA连接酶发挥邻近标记作用的实验原理,来自上海交通大学的科研团队研发了一项基于底物的新型邻近标记技术(专利号ZL202110069353.7),命名为Specific Pupyla-tion as IDEntity Reporter(SPIDER)。该技术可应用于蛋白-蛋白、核酸-蛋白、小分子-蛋白等相互作用的验证和发现。

本试剂盒基于SPIDER邻近标记技术,仅需准备生物素化标记的诱饵分子(诱饵DNA)，加入待反应样本(纯化蛋白、细胞/组织裂解液)及SPIDER反应体系启动反应,诱饵分子(Bait)和目标蛋白(Prey)之间的非共价结合被转化为目标蛋白和链霉亲和素之间的共价连接,随后目标蛋白可以被生物素琼脂糖亲和富集并进行质谱鉴定。

相比其他互作检测产品,该方法无需提前将标签和诱饵分子进行融合,摆脱对融合蛋白表达准确性的依赖,操作相对简单,应用范围广。此外,该产品后续使用严苛的条件进行清洗,可显著降低非特异蛋白的干扰,富集能力强,结果准确性更高,同时兼具操作简单快捷的优点。

二、产品应用范围

用于DNA的结合蛋白/靶标蛋白的筛选和发现

仅适用于体外反应

仅用于科学研究

四、需要您自行准备的主要试剂、耗材和仪器

1.生物素标记的DNA

1)诱饵DNA:生物素标记DNA,2rxns共需1.2nmol,建议最小浓度为10 μM。建议诱饵DNA的长度在50 nt以内，生物素与DNA之间的Linker需要足够长,至少2~3个PEG,防止生物素影响DNA与互作蛋白的结合。

2)对照DNA(可选):如果诱饵DNA为修饰DNA(如5mC),需要提供生物素标记非修饰DNA作为对照DNA,2rxns共需1.2nmol,建议最小浓度为10 M。建议对照DNA的长度在50 nt以内,生物素与DNA之间的Linker需要足够长,至少2~3个PEG,防止生物素影响DNA与互作蛋白的结合。

2.细胞/组织裂解液

4 rxns共需细胞/组织裂解液中总蛋白含量为12 mg,最小浓度不低于1 mg/mL。

特别提示:

细胞裂解时,Cell Lysate Buffer的有效成分建议使用非离子型去污剂，如1%NP-40其作用温和，保留蛋白的天然构象以及相互作用;酶抑制剂应避免使用AEBSF或带有AEBSF组分的Cocktai，AEBSF会抑制SPIDER反应。

3.其它需要的主要试剂

Tween 20:共需40 μL,可完成4 rxns。

4.耗材

需要使用无DNA酶的15 mL离心管,1.5 mLEP管,一次性吸头。

5.仪器

满足500xg微量离心机，以及15 mL离心管，500xg的水平离心机;涡旋振荡器,旋转混匀器(水平混匀器、三维混匀器可作为备选)37℃℃水浴锅，4℃℃冰箱。