一、产品简介

    邻近标记技术已被成功应用于鉴定蛋白靶标,相比传统的Pulldown/IP+MS技术,邻近标记技术可以解决鉴定弱或瞬时相互作用、研究膜蛋白等诸多问题。根据结核分枝杆菌类泛素蛋白酶体系统中底物Pup分子在体外能够招募PafA连接酶发挥邻近标记作用的实验原理,来自上海交通大学的科研团队研发了一项基于底物的新型邻近标记技术(专利号ZL202110069353.7),命名为Specific Pupyla-tion as IDEntity Reporter (SPIDER)。该技术可应用于蛋白-蛋白、核酸-蛋白、小分子-蛋白等相互作用的验证和发现。

     本试剂盒基于SPIDER邻近标记技术,仅需准备生物素化标记的诱饵分子,加入待反应样本(细胞)及SPIDER反应体系启动反应,诱饵分子(Bait)和目标蛋白(Prey)之间的非共价结合被转化为目标蛋白和链霉亲和素之间的共价连接，随后裂解细胞,目标蛋白可以被生物素琼脂糖亲和富集并进行质谱鉴定。

相比其他互作检测产品,该方法无需提前将标签和诱饵分子进行融合,摆脱对融合蛋白表达准确性的依赖,操作相对简单,应用范围广。 此外,该产品后续使用严苛的条件进行清洗,可显著降低非特异蛋白的干扰，富集能力强,结果准确性更高,同时兼具操作简单快捷的优点。

二、产品应用范围

用于完整细胞检测，适用于活细胞表面结合蛋白/靶标蛋白的筛选与发现

仅适用于体外反应

仅用于科学研究

四、需要您自行准备的主要试剂、耗材和仪器

1.生物素标记的小分子/重组蛋白

1)生物素标记的重组蛋白/小分子(Biotin-Bait):4 rxns共需4 nmol,建议最小浓度为10 μM,例如蛋白大小为50 kDa,最小摩尔浓度为10 μM,最小质量浓度为0.5 mg/mL;生物素标记位点尽量在最低程度上影响蛋白活性/小分子。

特别提示:

生物素与重组蛋白/小分子之间需要柔性Linker,建议2~3个PEG,防止重组蛋白影响生物素与链霉亲和素的结合,或者生物素影响重组蛋白/小分子表面构象与活性。

2)非标记小分子(重组蛋白无需准备):2rxns共需200nmol,建议最小浓度为1 mM。

2.细胞样本

1)贴壁细胞:准备4份待测细胞样本,将细胞培养于15 cm平皿中,长至90%以上,约2*107个细胞。

2)悬浮细胞: 4 rxns 共需8*107个细胞。

3.其它需要的主要试剂

Cell Lysate Buffer: 贴壁细胞进行反应4 rxns共需12 mL,悬浮细胞进行反应4 rxns共需4 mL。

酶抑制剂:如PMSF,添加至Cel Lysate Buffer中,终浓度为0.5 mM,防止蛋白降解。

特别提示:

建议使用RIPA(强)等作为细胞裂解液,有效成分为离子型去污剂如SDS,并在使用时加入终浓度为0.5 mM的酶抑制剂如PMSF,即加即用。酶抑制剂应避免使用AEBSF或带有AEBSF组分的Cocktai，AEBSF会抑制SPIDER反应。

4.耗材

15 mL离心管,1.5 mL EP管,一次性吸头。

5.仪器

可用于500xg的微量离心机，以及15 mL离心管，500xg的水平离心机;涡旋振荡器，旋转混匀器(水平混匀器、三维混匀器可作为备选);37℃水浴锅，4℃℃冰箱。

如有需要可联系我们：

电话：021-58952328

Q Q：3599547900 ；2087788560