卤化反应被用来辅助构建复杂分子并广泛应用于合成工业，已成为不可或缺的合成工具。在生物合成及生物催化领域，卤化酶也一直备受关注；但目前大多聚焦于黄素依赖的色氨酸卤化酶的表征、机制及简单底物的生物催化研究，作用于复杂底物的多卤化酶反应机制及区域选择性机制尚未得到解析。

在本项研究中，中国科学院上海有机化学研究所的唐功利研究员与北京大学的马明教授、南京大学的梁勇教授、华东理工大学的华强教授合作，表征了一个复杂多芳环聚酮天然产物Naphthacemycin生物合成途径中的黄素依赖卤化酶（FDH）NatC及其同源蛋白FasV，可催化Naphthacemycin B1于不同位点发生五次卤化后得到最终产物Naphthacemycin B13。通过酶动力学、时间-过程检测以及计算模拟，作者确定了FasV催化底物发生的是有序多卤化，这也说明FasV存在位点选择性从而促使卤化反应的有序发生。

通过解析FasV的蛋白晶体结构并分析其与化合物1的对接结果，作者大致锁定了与底物结合及反应相关的关键氨基酸残基（包括形成ᴨ-ᴨ相互作用的W91，F93和F95等、形成氢键相互作用以及形成蛋白活性口袋疏水环境的T53，L81和I212等）。通过蛋白定点突变，作者获得FasV的突变酶T53A，L81Y，F93W以及I212T均在一定程度上改善了FasV的区域选择性，尤其是I212T，在基本没有影响转化率的情况下，实现了对单一位点的选择。

随后结合序列分析，密度泛函理论计算和分子动力学计算，作者发现FasV采用一种独特的双活化机制。在FasV类多卤化蛋白当中，E49的羧基侧链接近S50的羟基侧链随后发生质子转移促使S50活化底物，从而降低反应所需活化能；底物被活化后，此前经K76活化的Cl⁺亲电进攻芳香底物，在此过程中，S50拔去底物卤化位置的氢原子以促进完成卤素的取代。这与以往所报道的PrnA类单卤化酶明显不同，且所依赖的关键氨基酸残基也不同。FasV所依赖的S50在PrnA中对应的氨基酸残基为丙氨酸，而PrnA所依赖的E346在FasV中所对应的则是亮氨酸，这也从另一个侧面表明多卤化酶采用一种与单氯化酶不同的催化机制。此外，FasV的晶体结构显示其具有较大的活性口袋且接近蛋白表面，意味着该蛋白可能具有宽泛的底物谱，具备发展为生物催化剂的潜力。为此作者尝试以化合物12为底物进行反应，在FasV的作用下，以75%的转化率生成其二氯化产物13。

至此，综合功能表征、酶动力学测定，蛋白结构表征以及蛋白突变，DFT计算和MD计算，作者全面阐述了FasV采用一种新颖的双活化催化机制促进多卤化反应的有序发生，同时获得了改善反应区域选择性的突变酶。本项研究拓展了人们对卤化酶催化机制的理解，展示了FasV类多卤化酶被开发为生物催化剂的潜力。