蛋白质翻译后修饰在细胞活动中极为重要，参与了各种关键的生命过程，然而由于缺乏可靠、方便和低成本的传感方法，只有少数翻译后修饰在蛋白质组层面被深入研究。纳米孔传感技术是一种强大的、无标签的单分子检测手段，通过目标分子穿过纳米孔引发的离子电流变化来识别分子。近年来，纳米孔传感技术已成功应用于检测多肽链中的翻译后修饰。但现有研究大多聚焦特定类型的翻译后修饰，并且对区分位置异构体方面还存在很大局限性。 近日，中国科学院化学研究所吴海臣研究员团队设计出了一种基于主客体相互作用的纳米孔传感策略用于蛋白上翻译后修饰的高效识别。该方法可以识别多肽探针特定位点的20种天然氨基酸和13种翻译后修饰，通过将短肽纳入探针来扩展这一策略，从而能够区分各种PTM、位置异构体以及目标多肽上的多个翻译后修饰。 作者发现，利用苯丙氨酸（F）与葫芦脲[7]（CB[7]）之间的主客体相互作用，可以显著增强多肽探针与纳米孔之间的相互作用，产生均一且稳定的电流阻滞信号。基于此，作者构建出了FGXD8探针，其中FG主要与CB7产生主客体相互作用，“X”为20种天然氨基酸或翻译后修饰的氨基酸，D8为八个天冬氨酸，提供多肽穿过纳米孔的电泳力。利用这种探针的高分辨率，结合野生型α溶血素纳米孔（αHL）以及突变纳米孔(M113F)7 αHL，作者实现了对于包括甲基化、乙酰化、磷酸化、硫酸化和糖基化的13种翻译后修饰以及20种天然氨基酸的完全区分。
作者进一步尝试将FGXD8中“X”的位置替换为短肽，构成FG-pep-D8探针。以阿尔茨海默症密切相关的tau蛋白为研究对象，选取tau蛋白突变体2N4R R1微管结合域的一段短肽（N’-SKIGSTEN-C’）作为模型肽，对短肽多个位点的磷酸化、甲基化和乙酰化展开研究。该体系对模型肽的多种翻译后修饰、位置异构体和多个翻译后修饰都展现出良好的识别能力。通过机器学习辅助区分这些探针的信号，识别的准确率高达0.941。 最终，作者将这一方法应用于tau蛋白碎片的磷酸化修饰的检测。他们选取了tau 2N4R结构域的两条胰蛋白酶/赖氨酸蛋白酶的水解产物肽，通过将这两条酶切产物肽分别连接上FG和CD8构成FG-pep-CD8探针，利用该探针穿过纳米孔时产生的特征电流信号成功区分了这两条多肽及其四种磷酸化异构体。 随着进一步的改进，该方法有望应用于实际生物样品中的翻译后修饰检测，为传统质谱方法提供有效的替代方案，并在生物医学检测领域展现出巨大的应用潜力。 论文信息 Nanopore-Based High-Resolution Detection of Multiple Post-Translational Modifications in Protein Ziyi Li, Yakun Yi, Yun Zhang, Yuanyuan Xiao, Qianyuan Ren, Ke Zhou, Lei Liu, Hai-Chen Wu Angewandte Chemie International Edition DOI: 10.1002/anie.202423801
