肠道菌群由于其复杂的组成和难于体外培养等特性，也被称为肠道“暗物质”。肠道菌群具有复杂多样的生理病理功能，但某一特定功能往往由特定的菌群亚群执行，因此开发肠道细菌选择性标记策略对于解析特定细菌的功能具有重要意义，同时也有助于理解微生物群落中存在的结构与分子多样性。然而，现有的肠道细菌选择性标记方法较为少见。 近日，复旦大学王炜研究员、麻锦彪教授和厦门大学杨朝勇教授团队合作，基于细菌肽聚糖肽尾中L-氨基酸的多样性，开发了一种荧光L-氨基酸（Fluorescent L-amino acid，FLAA）探针，该探针可通过代谢标记的方式在体选择性标记小鼠肠道共生菌群中一个主要的革兰氏阳性细菌科—毛螺菌科（Lachnospiraceae）。
首先，作者给小鼠灌胃FLAA后，发现其的确可以标记小鼠肠道中的部分细菌，且被标记的细菌具有相对一致的细胞形态。此外，通过荧光共定位成像及变溶菌素酶解细菌细胞壁实验，作者明确了探针的标记靶标是肽聚糖。 接下来，作者利用流式细胞分选结合16S rDNA测序发现探针标记的细菌多为毛螺菌科。而后，作者使用分别靶向Lachnospiraceae科以及该科中的几个属（Roseburia、Lachnospiraceae_NK4A136和Lachnoclostridium）的FISH探针对FLAA探针的特异性进行了验证。此外，作者还对毛螺菌科下的几株细菌进行了体外培养与标记，证明了FLAA的体外标记能力。 而后，作者以毛螺菌科的一株Roseburia faecis 菌为对象，对探针的标记机理进行了进一步表征。一方面，通过质谱分析确定了LAA的标记位点为肽聚糖肽尾的1号位氨基酸。另一方面，作者通过体外蛋白表达纯化、酶促反应及动力学参数测定等分析手段，揭示了R. faecis中负责催化第1号位氨基酸偶联的MurC连接酶（RfMurC）相比其他细菌的MurC具有明显更高的氨基酸底物容忍性。 为深入理解RfMurC对非典型氨基酸底物的容忍性，作者通过X射线晶体衍射解析了其分子结构，发现RfMurC中氨基酸结合域的位置与其他细菌的MurC相比具有显著差异，并且其三个结构域组成的底物结合空间明显较其他细菌的更大，这在某种程度上解释了RfMurC为何具有更高氨基酸底物容忍性。 最后，作者考虑到肽聚糖片段具有通过激活NOD1/2受体参与宿主固有免疫激活的作用，再结合实验中发现的肠道共生菌肽聚糖第1号位存在非典型氨基酸的事实，作者进一步探究了包含非Ala的肽聚糖片段对NOD1/2受体的激活情况。发现相比于典型肽聚糖片段，第1号位含有非典型氨基酸的肽聚糖片段对NOD1/2受体的激活明显下调甚至失活。 综上，该工作基于荧光L-氨基酸探针开发了在体选择性标记毛螺菌科细菌的代谢标记策略，明确解析了探针的标记位点并发现了毛螺菌科中独特的MurC结构和肽聚糖组成。该策略的开发有望为深入研究毛螺菌科这一具有重要生理功能的菌群亚群提供帮助。 该工作共同第一作者为厦门大学博士研究生杜雅慧和复旦大学王翌霞博士，通讯作者是复旦大学王炜研究员、厦门大学杨朝勇教授和复旦大学麻锦彪教授。 论文信息 Unusual MurC Ligase and Peptidoglycan Discovered in Lachnospiraceae Using a Fluorescent L-Amino Acid Based Selective Labeling Probe Yahui Du, Yixia Wang, Ming Yang, Liyuan Lin, Jie Zhang, Zhi Huang, Chang Liu, Shuangjiang Liu, Jinbiao Ma, Chaoyong Yang, Wei Wang Angewandte Chemie International Edition DOI: 10.1002/anie.202503049
