分享一篇近期发表在JACS上的文章,题目为Self-Generative Singlet Oxygen (1O2)‑Initiated Chemical Modification of Nuclear DNAs Combats Tumor Drug Resistance。文章的通讯作者是苏州大学的史海斌教授。
多药耐受性是肿瘤化疗的主要问题,使用多种治疗模式结合可以有效解决此问题。
图1. 自生成单线态氧引发核DNA化学修饰示意图
本文作者在此前的工作中证实,酶或光介导的内源RNA共价修饰能够作为非化疗的模式有效杀伤肿瘤,而DNA作为细胞核中最重要的基因物质,其共价化学修饰具有良好的耐药肿瘤治疗潜能。因此,本文作者将能够在肿瘤微环境中产生大量单线态氧的四羧基苯基卟啉铜(Cu-TCPP)和连有呋喃以及阿霉素药物(Dox)的正电荷穿膜肽(fTAT-Dox)共同封装在叶酸-聚乙二醇-聚己内酯(FA-PEG-PCL)以及聚乙二醇-聚己内酯(PEG-PCL)组装成的胶束中,构成肿瘤靶向的纳米粒子FA(CT-fT-Dox)。该纳米粒子能够在叶酸的作用下被肿瘤细胞摄取并解散释放出Cu-TCPP和fTAT-Dox,Cu-TCPP将肿瘤部位富集的过氧化氢转化为单线态氧,而fTAT-Dox则能够进入细胞核,在单线态氧的催化下其中的呋喃环通过环化反应与DNA共价连接,延长Dox作用时间的同时阻碍DNA的复制和转录,共同实现肿瘤的治疗。
图2. FA(CT-fT-Dox)体外自生成单线态氧
如图2所示,作者制备了FA(CT-fT-Dox)胶束。紫外可见光谱中可同时观察到Cu-TCPP和Dox的峰,证实了两种组分皆被成功封装。TEM和DLS证实了该胶束在水溶液中具有稳定的单分散形貌。此外,对Dox在不同溶液中的释放测试显示,在pH为5.5的溶液中,Dox以较快速率释放,而在pH为7.2的溶液中则释放较慢,酸性条件下的释放证实了该胶束在肿瘤微环境中的响应性。Cu-TCPP能够通过Russell机制将过氧化氢转化为单线态氧,因而作者利用单线态氧传感器检测了该体系在过氧化氢存在下产生单线态氧的能力,荧光信号随时间的增加证实了其良好的单线态氧产生效果。
图3. 单线态氧引发核DNA化学修饰增强Dox的细胞保留
如图3所示,作者表征了该胶束在细胞中的单线态氧产生能力。荧光成像显示,仅有FA(CT-fT-Dox)和不含呋喃环的对照组FA(CT-T-Dox)具有单线态氧产生效果,不含Cu-TCPP的组都未观察到荧光。接下来,由于单线态氧能够抑制药物外排泵P-糖蛋白(P-gp)的表达,作者通过WB检测了P-gp的表达量,并证实了FA(CT-fT-Dox)组和FA(CT-T-Dox)组细胞中的P-gp表达量显著降低,证实了Cu-TCPP能够产生单线态氧破坏耐药性。作者此前证实呋喃环能够被单线态氧氧化后与碱基发生环化,因而作者检测了此过程对药物的细胞摄取与停留的影响。对细胞的荧光成像显示FA(CT-fT-Dox)组具有最慢的荧光下降,证实了Dox的长时间滞留。此外,FA(CT-fT-Dox)和FA(CT-T-Dox)组中能观察到Dox在核中的比例增加,这可能与单线态氧能够促进fTAT-Dox溶酶体逃逸并进入细胞核有关。对细胞的3D成像也验证了此结果,在72小时时,FA(CT-fT-Dox)具有最高的细胞核比例。作者将Dox更换为Cy5荧光染料,通过凝胶电泳中DNA条带与Cy5信号位置重合证实了该体系能够共价连接至DNA上。
图4. 细胞毒性和DNA损伤效果
如图4所示,作者通过细胞活死染色和流式细胞术证实了FA(CT-fT-Dox)具有最好的细胞杀伤效果。彗星实验和γH2AX免疫荧光成像证实了FA(CT-fT-Dox)能产生最多的DNA损伤,凝胶电泳也显示出DNA被碎片化。Bio-TEM成像中观察到细胞形态的显著破坏也证实了FA(CT-fT-Dox)的细胞杀伤效果。
图5. 转录组测序分析和蛋白质组学分析
如图5所示,作者进行了转录组测序。FA(CT-fT-Dox)与PBS以及与FA(CT-T-Dox)之间有差异基因的数目远大于PBS和FA(CT-T-Dox),证实了FA(CT-fT-Dox)对细胞的基因表达有重大影响。基因丰度显示有关细胞周期、DNA复制以及DNA修复的基因表达显著下调。热图分析也显示许多细胞周期相关的生物标志物在FA(CT-fT-Dox)组中下调。此外,作者进行了蛋白质组学分析,FA(CT-fT-Dox)组的蛋白质表达也具有很大差异,许多与细胞分裂、有丝分裂细胞周期、DNA复制与DNA修复相关的蛋白表达都显著下调。
图6. 自生成单线态氧引发核DNA化学修饰的体内表征
由于FA(CT-fT-Dox)在680-800 nm处有较强的吸收,具有光声效应,有望作为光声成像造影剂使用。因此如图6所示,作者向荷瘤小鼠中静脉注射FA(CT-fT-Dox)验证其光声成像应用。光声成像结果显示,FA(CT-fT-Dox)组的小鼠肿瘤处能观察到显著的光声信号,不含Cu-TCPP的对照组则无信号产生。接下来,作者证实了FA(CT-fT-Dox)在肿瘤微环境中将过氧化氢转化为单线态氧的能力。瘤内注射单线态氧传感器分子,仅有FA(CT-fT-Dox)和FA(CT-T-Dox)有显著荧光信号,证实这两组中单线态氧的产生。对肿瘤中Dox含量的检测也显示FA(CT-fT-Dox)组具有最长的肿瘤滞留时间。
图7. 体内治疗效果评估
如图7所示,作者证实了FA(CT-fT-Dox)的肿瘤治疗效果。对于肿瘤体积和质量的检测显示出FA(CT-fT-Dox)具有最好的肿瘤抑制效果,组织病理学检测和免疫荧光染色也都证实FA(CT-fT-Dox)具有最好的疗效。
综上所述,本文开发了一种由能产生单线态氧的Cu-TCPP和含呋喃环及化疗药物的穿膜肽所构成的胶束,能够在富过氧化氢的肿瘤微环境中通过Cu-TCPP的催化产生单线态氧,促使呋喃环和细胞核中的DNA共价连接,延长了药物作用时间的同时破坏核DNA,从而有利于对耐药肿瘤的治疗。
作者:ZHR 审校:ZXY
DOI: 10.1021/jacs.5c02826
Link: https://doi.org/10.1021/jacs.5c02826