分享一篇发表在Cell Chemical Biology上的文章，题目为“Structural and mechanistic analysis of covalent ligands targeting the RNA-binding protein NONO”，通讯作者是来自Scripps研究所的Benjamin F. Cravatt教授和来自西澳大学的Charles S. Bond教授，他们的主要研究方向是化学蛋白质组学和解析生物大分子的三维结构。

RNA结合蛋白（RBP）是一类参与基因表达、转录、以及转录后调控多种生物学过程中的一类重要蛋白。但由于RBP常常在细胞中形成动态复合物，难以找到用于靶向调控的小分子药物。Benjamin F. Cravatt教授团队于此前通过化学蛋白质组学的策略报道了一种用于靶向RNA结合蛋白NONO的一种手性依赖性的小分子配体(R)-SKBG-1，为RBP寻找相应的小分子配体提供了一种新的思路。本文作者则进一步从结构的角度解释了共价化合物诱导NONO-RNA相互作用趋于稳定的分子机制，同时开发了一种在蛋白质组学范围内选择性更好、并能抑制癌细胞生长表型的新型氯氟乙酰胺小分子配体。

首先作者表达并纯化了NONO蛋白的同源二聚体，随后用小分子配体(R)-SKBG-1进行处理并解析晶体结构。在晶体结构中能够看到明显的C145位上的共价加合物，并且存在多种稳定的相互作用，例如Cys主链N原子和配体的立体中心间、以及乙酰胺基团和Q229残基间形成的氢键相互作用，苯氧基和蛋白上多种芳香性残基间形成的堆叠作用。同时作者认为，小分子配体的共价连接并不会造成原本NONO蛋白中的两个RNA结合结构域的封闭，反而会以一种较为柔性的构象存在于结合口袋附近，当RNA靠近时，两个苯氧基基团会为RNA结合提供更多的堆叠相互作用，从而稳定RBP和RNA的复合物，而上述这些共价加合物和相互作用都不会存在于其他几种不含C145残基的NONO同源蛋白中。

另一方面，作者考虑到(R)-SKBG-1以反应性较强的氯乙酰胺作为反应弹头，在蛋白质组中会引起脱靶，因此作者测试了另外一种反应性降低的反应弹头——氯氟乙酰胺。对不同手性的化合物进行测试，发现了一种(R,R)-GL-373化合物以手性依赖性的方式对NONO的C145进行共价结合。作者通过Gel-ABPP分析该化合物衍生的炔基探针对蛋白质组的标记选择性，发现仅当Cys未突变时，能够以较高的选择性被标记到，并且这种标记可以被原有小分子的预处理所竞争掉。作者发现，无论是Gel-ABPP或组学数据中均表明，新的基于CFA反应基团的探针相比原有氯乙酰胺探针都具有更好的蛋白质组选择性，表现出远远更少的脱靶。

最后作者对转录组的变化进行分析，表明由于CFA的配体小分子亲电性更弱，引起的亲电应激行为更少，因此蛋白组和转录组的变化更能体现由于NONO蛋白被共价标记后的系列变化行为。

总的来说，本文作者通过解析此前发展的NONO共价配体和蛋白间偶联的晶体结构，解释了配体在增强RNA和RBP互作过程中所起到的作用，并据此开发出一种基于氯氟乙酰胺活性弹头的共价配体分子，这种CFA的配体表现出更高的立体选择性和NONO依赖性的抗增殖表型，具有临床应用的广阔前景。

本文作者：SHL

责任编辑：WYQ

DOI：10.1016/j.chembiol.2025.12.010

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.chembiol.2025.12.010