分享一篇发表在ACS central science上的文章，题目为“Directed Evolution of Enzymes for Bioorthogonal Chemistry Using Acid Chloride Proximity Labeling”，通讯作者是来自Wisconsin-Madison大学的Jeffery D. Martell教授以及芝加哥大学的的Byran C. Dickinson教授，Martell教授的研究方向是生物化学催化剂和非生物化学催化剂，Dickinson教授的研究方向是合成化学、蛋白质工程和分子进化。

生物正交保护基与催化剂的结合已成为实现分子活性时空调控的重要策略。酶作为催化剂具有基因可靶向的优势，但天然酶往往无法高效断裂特定保护基。现有技术虽已开发出如1-甲基环丙基（mCP）酯等生物正交保护基，并利用猪肝酯酶（PLE）或枯草芽孢杆菌酯酶（BS2）进行去保护，但mCP在哺乳动物细胞中仍存在明显的背景活性，限制了其在复杂生物环境中的应用。本文旨在开发新的酯基保护剂以及对应的酶去解决这一问题。

首先，为了获得新的更稳定的酯基保护剂，作者从mCP出发，合成了5种新的酯基保护荧光素，从中筛选出了新的背景最低的苯基环丙基（pCP）酯保护基。由于苯基的大的空间位阻，其稳定性显著优于mCP。

但是天然的BS2对pCP的催化脱除效率也很低，于是作者后续开发了通过掩蔽酰氯探针的定向进化酶（DEEPMACh）平台，用于筛选pCP的脱除酶。具体来说，就是将酵母表面展示与邻近标记化学相结合，通过在酵母表面展示酶突变体库，利用掩蔽酰氯探针（如AC-2和SP-d5）在活性酶附近释放酰氯，共价标记酵母表面亲核基团，再通过流式细胞分选筛选高活性突变体。作者以BS2为起点，通过两轮进化（首轮针对mCP，次轮针对pCP），获得对pCP活性大幅提升的突变体。

最后，作者验证了新的pCP保护基在亚细胞区室邻近标记的应用。作者在不同的亚细胞区室表达进化后的BS2酶，然后利用pCP保护的荧光素进行处理，最终进行细胞成像。结果显示荧光信号和BS2酶高度共定位，证明了其亚细胞区室邻近标记的可靠性。作者最后还将该方法用于RNA邻近标记。

总的来说，本文开发了pCP作为背景信号更低的酯基酯基保护基，并进化出其对应的高活性脱保护酶，未来可应用于成像、靶向药物释放等领域。

本文作者：YDP

责任编辑：WYQ

DOI：10.1021/acscentsci.5c01746

原文链接：https://doi.org/10.1021/acscentsci.5c01746