分享一篇发表在Nature Communications上的文章，题目为“Covalent modification of a glutamic acid inspired by HaloTag technology”。通讯作者是来自德国马克斯·普朗克分子生理学研究所的Herbert Waldmann教授，他的研究方向聚焦于化学生物学与药物发现，致力于通过开发新型化学工具来精准调控蛋白质的功能。

在目前的靶向共价抑制剂（TCI）开发中，绝大多数亲电“弹头”都针对半胱氨酸（Cys），其在蛋白组中的丰度仅为2.3%。相比之下，天冬氨酸（Asp）和谷氨酸（Glu）的丰度高达12%，是极具潜力的靶点。但由于这两类氨基酸在生理条件下亲核性较弱且形成的酯键易水解，针对它们的共价抑制剂研发一直步履维艰。虽然已有一些针对酸性残基的探针如炔酰胺（ynamides）或四唑（tetrazoles）用于蛋白质组分析，因其反应活性和选择性有限，很难用于开发高特异性的TCI。在本文中作者选取了脂蛋白结合伴侣蛋白PDEδ作为研究模型，该蛋白的疏水结合口袋中含有一个关键的谷氨酸残基p.E88，且不含可靶向的半胱氨酸。作者从HaloTag技术中汲取灵感：HaloTag利用氯代烷烃与蛋白深处的Asp残基反应形成极稳定的酯键。作者认为，PDEδ的p.E88虽不处于口袋最深处，但同样深埋于强疏水微环境之中。这种设计思路的核心在于利用疏水性来屏蔽水分子，从而保护形成的酯键免受水解，实现真正的不可逆封锁。

作者首先对探针结构进行了系统性的理性优化。作者以PDEδ蛋白高亲和力的可逆抑制剂 Deltazinone 1为起始骨架，通过引入哌啶环作为“锚点”来增强与C56的相互作用。优化的关键突破是将酰胺键替换为磺酰胺键，其更自由的旋转能力使弹头能够精准地“瞄准”p.E88。最终，通过调整烷基链长、引入溴代弹头以及增加构象约束，作者成功开发出了高效探针6a，即DeltaTag。DeltaTag在测试的化合物系列中表现最为突出，其标记效率达到了95%以上。MALDI-TOF质谱分析直观地证明了共价加合物的形成：在处理24小时后，DeltaTag (6a) 使PDEδ蛋白的质谱峰发生了完全位移。

作者接下来进行位点特异性研究。LC-MS/MS鉴定确认修饰发生在包含p.E88的特定肽段上。X射线共晶结构展示了DeltaTag与p.E88侧链之间形成的连续电子密度，确证了共价酯键的形成。

随后，作者在复杂的生物体系中验证了DeltaTag的靶向效能。作者在Jurkat细胞裂解液中进行的CETSA实验显示，孵育2小时后DeltaTag使PDEδ的热稳定性显著提升，熔点移位（ΔTm）高达22.1 ± 1.0 °C，这与共价修饰随时间增强的特性相吻合。为了评估全蛋白组范围内的选择性，作者利用TPP技术在近4000个蛋白中进行了分析，火山图结果显示PDEδ 是唯一的显著稳定靶点。此外，活细胞内的共价标记实验通过Western Blot观察到了明显的分子量上移条带，证明了DeltaTag能够穿透细胞膜并在复杂的细胞内环境中完成共价结合。

总而言之，本研究受HaloTag技术启发开发了共价探针DeltaTag，实现了对谷氨酸残基的高效、位点特异性共价锁定。

本文作者：TZM

责任编辑：LZ

DOI：10.1038/s41467-026-68999-9

原文链接：https://www.nature.com/articles/s41467-026-68999-9