在金属有机实验室内，金属络合物催化反应的机理往往不同于生物体内金属催化的反应机理。因此，如果能把非生物体系的催化中间体应用到生物体系，那么就能大大扩展生物体内酶促反应的应用范围。为了达到这个目标，化学家已经发展了一系列策略，比如酶的定向进化及人工金属酶的设计。但是，这些策略应用范围仍然极其有限。作为金属有机化学领域的一类重要中间体，单核金属–氢负中间体能够参与许多有机反应；但是利用单核金属–氢负为反应中间体的酶促反应在自然界中并不存在。在生物体内，与锌离子协同催化反应的酶非常普遍，其中的碳酸酐酶更是早已被深入研究。简单来说，碳酸酐酶是把二氧化碳转化为碳酸，反应机理经过了一个路易斯酸和氢键的协同催化作用以实现氢氧根对二氧化碳的加成（图1a左）。在此背景下，加州大学伯克利分校的Hartwig课题组设想如果能把二氧化碳亲电试剂换为酮，同时把被转移的氢氧根换成氢负离子，那么碳酸酐酶就实现了对酮的还原（图1a右）。同时考虑到酶促反应的手性环境，该反应极有可能会具有优秀的对映选择性，这样就可以在不使用复杂NADPH复杂辅基（图1b）的情况下实现羰基的酶促不对称还原。在此思路引导下，他们发展了一个利用硅氢试剂为还原剂，能够高立体选择性地还原酮为手性二级醇的新反应（图1c）。该工作近期发表在《Nat. Chem.》上。
图1：研究背景及该文工作。图片来源：Nat. Chem.在有机化学领域，烷氧锌或者氟化锌试剂能够与硅氢反应生成Zn-H中间体。鉴于此反应，作者设想，当向碳酸酐酶促反应中添加硅氢还原剂时，原有的烷氧锌就有可能与硅氢反应生成Zn-H中间体。在确定了研究切入点后，作者选择4–乙酰基吡啶1为底物，评估了不同硅氢试剂的还原活性（表1），最终发现当使用PhSiH3为还原剂时反应效果最好（99%收率，98% e.e.值，entry 1）。对照反应表明，硅氢试剂对该不对称还原反应极为重要。把PhSiH3更换为PhMeSiH2时，虽然对映选择性不变，但是反应产率降为78%（entry 2）。当把把PhSiH3更换为PhMe2SiH、Et3SiH、(Me3SiO)2MeSiH、(iPr)2SiH2时，反应则完全不能发生（entry 3-7）。不出意外，在无酶参与的条件下，反应也不能进行（entry 8）。进一步的对照反应表明，不同的碳酸酐酶具有不同的催化活性：在各种碳酸酐酶中，hCAII的反应活性最高（entry 9-10）。表1：不对称还原反应的条件优化。图片来源：Nat. Chem.在酶促反应研究领域，反应中使用的酶往往需要通过蛋白纯化技术得到，但是蛋白提纯往往极为耗时。从实用性角度来讲，如果能直接使用含有目标酶的整个细胞进行催化反应，无疑就会大大提高反应效率。所以，作者进一步研究了利用含有最优碳酸酐酶的整个细胞来催化该还原反应的可能性（图2）。如图2a所示，纯化的酶、含有酶的正常整个细胞、在零下20 C存放三天的正常整个细胞及冻干的含有酶的整个细胞都能催化反应。虽然不同环境下的酶都能以高对映选择性还原底物，但是在零下20 C存放三天的正常整个细胞催化反应的产率却仅有46%，而另外三种条件下的酶都能以95%的收率还原底物酮（图2a）。随后，作者选用了含有氘代原子的PhSiD3 作为氢源来参与反应。结果表明，D原子以99%的 比例被引入到还原产物中（图2b）。为了进一步研究该反应的实用性，作者进行了放大规模实验。在克级规模下，标准反应底物的产率为93%、e.e. 值为97%（图2c）。图2：应用细胞进行不对称还原。图片来源：Nat. Chem.在确定了最优反应条件后，作者评估了该酶促还原反应的底物使用范围（表2）。结果表明，许多苯乙酮类底物都能被高效还原。除了简单的苯乙酮（7），对位含有不同取代基的苯乙酮也能以优秀产率、几乎完美的对应选择性被还原（8-12）。邻位、间位的取代基对反应也几乎没有影响（13-14，17）。但是当邻位取代基为-Cl时（15），反应的对应选择性降为80%，对于底物16，对应选择性又重回95%。所以，该反应的取代基及位阻效应似乎并没有一个统一的规律。对于非苯乙酮类底物，反应也能成功进行（18-22）。除了苯环及萘环外，其他杂环酮类底物，包含吡啶、哒嗪、呋喃及噻吩也能被兼容（23-28）。对于二羰基底物，反应能高选择性、高产率地还原具有较小位阻的羰基（29-30）。表2：适用于该反应的底物范围。图片来源：Nat. Chem.从机理角度来讲，路易斯酸和硅氢还原剂协同还原酮为醇可以经过以下两种反应机理：第一种是锌离子作为路易斯酸活化羰基，然后硅氢直接产生氢负离子进攻活化的羰基最终生成醇；第二种是锌与硅氢反应生成Zn-H中间体，然后该金属氢负中间体还原酮为醇。所以，在不加酮底物的时候，通过判断是否能产生氢气就能区分这两种反应机理，这是因为硅氢与水反应不会产生氢气但是金属氢负中间体则能与水反应生成氢气。所以，作者就做了对照反应（图3a）：在无底物参与的条件下，在正常水作为溶剂时，反应放出了H2；而在氘代水作为反应溶剂时，反应放出的则为HD。该实验有利证明了反应经历了一个锌与PhSiH3生成的Zn-H中间体。在排除了锌离子作为路易斯酸活化底物羰基的反应机理后，作者又提出了另外两种可能的反应机理（图3b）：第一种是与锌配位的氢氧根作为碱与硅氢配位后可以活化硅氢，活化的硅氢可以直接还原羰基；第二种则是通过一个Zn-H中间体还原羰基。如果反应是经过图3b所示的第一种机理的话，那么具有不同产生氢负离子能力的硅氢就会具有不同的反应效果；如果是第二种，则不会有明显的差别。在此思路下，作者对比了不同硅氢的还原能力（图3c）。PhSiH3和PhMeSiH2相比，PhMeSiH2具有更强的产生氢负的能力；但是对照反应却显示在该反应中，两者的还原能力几乎一样。该实验就排除了图3b中的第一种假设而间接证明了第二种机理。为了获得更多的数据来支撑Zn-H中间体的生成，作者合成了三配位的Zn-O和Zn-F中间体，然后观察其能否与硅氢反应生成Zn-H结构。结果证实，在模拟碳酸酐酶的三配位环境下，Zn-O和Zn-F中间体都能与硅氢反应生成Zn-H结构（图3d）。图3：酶促还原反应机理研究。图片来源：Nat. Chem.为了进一步研究该反应的反应机理，作者运用了QM/MM方法对反应机理做了计算。计算结果表明，PhSiH3、反应底物都能合理地与酶促反应位点结合；同时反应位点附近的氨基酸也能通过氢键作用活化底物中的羰基（图4a-d）。在综合所有证据后，作者提出了如下的反应机理：天然的碳酸酐酶中的Zn反应位点可以与硅氢试剂进行作用而生成Zn-H中间体，随后被氢键活化的羰基底物可以被该氢负试剂还原，还原得到的烷氧中间体与水作用后生成目标还原产物同时实现酶活性位点的循环（图4e）。在作者进行底物普适性探索时，作者发现，当邻溴苯乙酮为反应底物时，反应的非对映选择性仅仅为10%（图4f）。为了研究该底物为何如此特殊，作者特别运用计算方法模拟了该底物与酶可能的结合方式。结果表明，除了氢键作用外，溴原子也可以通过卤键作用与酶结合。两种不同的作用使得Re、Si结合方式能量差别不大，进而使得酶的手性环境并不能区分这两种结合方式，最终造成还原该底物时的对映选择性极低（图4g，4h）。图4：氢负离子产生及转移过程的计算研究。图片来源：Nat. Chem.总结：在这篇文章中，Hartwig课题组报道了一个利用碳酸酐酶作为催化剂、硅氢作为还原剂还原酮为二级醇的新方法。该方法能够以高产率、高对映选择性还原不同的酮，同时能够兼容不同的官能团及杂环，具有极强的实用价值。更重要的是，该反应巧妙结合了自然界中存在的天然酶与实验室中的非天然还原剂，成功实现了天然酶不能实现的新反应，为发展其他酶促反应提供了新思路。Ji, P., Park, J., Gu, Y. et al. Abiotic reduction of ketones with silanes catalysed by carbonic anhydrase through an enzymatic zinc hydride. Nat. Chem. (2021). https://doi.org/10.1038/s41557-020-00633-7
来源：高分子科学前沿
